توضیحات
رنگ آمیزی اندوسپور (Endospore Staining)
اصول، شناساگرها، روش و نتیجه رنگ آمیزی اندوسپور
مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی اندوسپور
در سال 1922 میلادی، Dorner روشی را برای رنگ آمیزی اندوسپورها ارائه داد. Shaeffer و Fulton روش Dorner را در سال 1933 میلادی اصلاح کردند تا این فرآیند را سریعتر کنند. رنگ اندوسپور یک رنگ افتراقی است که به طور انتخابی اندوسپورهای باکتریایی را رنگ می کند. هدف اصلی از رنگ آمیزی اندوسپور، افتراق اسپورهای (Spore) باکتری از سایر سلول های رویشی و افتراق ارگانیسم های تشکیل دهنده اسپور از غیر اسپور است.
اصول روش رنگ آمیزی اندوسپور
اندوسپورهای باکتریایی، ساختارهای متابولیکی غیرفعال و بسیار مقاومی هستند که توسط برخی باکتری ها به عنوان یک استراتژی دفاعی در برابر شرایط محیطی نامطلوب تولید می شوند. باکتری ها می توانند در این حالت باقی بمانند تا زمانی که شرایط مساعد شود و بتوانند جوانه زده و به حالت رویشی خود بازگردند.
در روش Schaeffer-Fulton، یک رنگ اولیه به نام مالاشیت گرین (Malachite green) با بخار دادن امولسیون باکتری به داخل اسپور وارد می شود. مالاشیت گرین قابل حل در آب است و میل ترکیبی کمی با مواد سلولی دارد، بنابراین سلول های رویشی ممکن است با آب بی رنگ شوند. سپس سافرانین (Safranin) برای رنگ آمیزی ثانویه سلول هایی که رنگ زدایی شده‌اند به کار می رود. در پایان فرآیند رنگ آمیزی، سلول های رویشی صورتی و اندوسپورها سبز تیره می شوند.
اسپورها ممکن است در وسط سلول، در انتهای سلول یا بین انتهای و وسط سلول قرار گیرند. شکل اسپور ممکن است برای تشخیص بیماری نیز مفید باشد. اسپورها ممکن است کروی یا بیضوی باشند.
شناساگرهای مورد استفاده برای رنگ آمیزی اندوسپور
رنگ آمیزی اولیه: مالاشیت گرین (محلول آبی 0.5 درصد (وزنی/حجم))
5 گرم مالاشیت سبز
100 میلی لیتر آب مقطر
عامل رنگ زدا
آب لوله کشی یا آب مقطر
رنگ ثانویه: سافرانین
محلول ذخیره (محلول الکلی 2.5% (وزنی/حجمی))
5 گرم سافرانین O (Safranin O)
100 میلی لیتر اتانول 95 درصد
روش رنگ آمیزی اندوسپور
یک لام تمیز بدون چربی بردارید و با استفاده از یک تکنیک استریل، اسمیر را به آن اضافه کنید.
آن را با هوا خشک کنید و با حرارت ارگانیسم را روی یک لام شیشه‌ای ثابت کنید. سپس با یک کاغذ خشک کن مربعی یا یک تکه پارچه حوله ای روی لام را بپوشانید.
کاغذ خشک کن را به محلول رنگ مالاشیت گرین آغشته کنید و به مدت 5 دقیقه بخار دهید. کاغذ را مرطوب نگه دارید و در صورت نیاز رنگ بیشتری به آن اضافه کنید. یک راه دیگر این است که اسلاید را می توان روی یک ظرف آب جوش، بخار داد.
لام را با آب لوله کشی بشویید.
با رنگ ثانویه سافرانین 0.5 درصد به مدت 30 ثانیه رنگ کنید. سپس آن را با آب لوله کشی بشویید و رنگ را خشک کنید.
لام را زیر میکروسکوپ از نظر وجود آندوسپور بررسی کنید. اندوسپورها سبز روشن و سلول های رویشی قرمز مایل به قهوه ای تا صورتی هستند.
نتایج روش رنگ آمیزی اندوسپور
اندوسپورها: اندوسپورها سبز روشن هستند.
سلول های رویشی: سلول های رویشی قرمز مایل به قهوه ای تا صورتی هستند.
اسپورها ممکن است در وسط سلول، در انتهای سلول یا بین انتها و وسط سلول قرار گیرند. شکل اسپور ممکن است برای تشخیص بیماری نیز مفید باشد. اسپورها ممکن است کروی یا بیضوی باشند.
رنگ آمیزی اندوسپور به روش Dorner
رنگ کربول فوشین (Carbol fuchsin)
3 گرم فوشین بازی (Basic fuchsin)
10 میلی لیتر اتانول، 95٪ (vol/vol)
5 میلی لیتر فنل (Phenol) (کریستال‌های ذوب شده با حرارت)
95 میلی لیتر آب مقطر
فوشین بازی را در اتانول حل کنید. سپس فنل حل شده در آب را اضافه کنید. مخلوط کنید و بگذارید چند روز بماند. قبل از استفاده فیلتر کنید.
حلال رنگ زدا (اسید الکل)
97 میلی لیتر اتانول، 95 درصد (حجمی/حجمی)
3 میلی لیتر اسید کلریدریک (غلیظ)
رنگ ثانویه (محلول نیگروسین (Nigrosin))
10 گرم نیگروسین
100 میلی لیتر آب مقطر
روش
یک لام تمیز غیر چرب بردارید و با استفاده از یک تکنیک استریل اسمیر را به آن اضافه کنید.
آن را با هوا خشک کنید و با حرارت ارگانیسم را روی یک لام شیشه ای ثابت کنید. سپس با یک کاغذ خشک کن مربعی یا یک تکه پارچه حوله ای روی اسلاید را بپوشانید.
کاغذ خشک کن را به کربول فوشین آغشته کنید و به مدت 5 تا 10 دقیقه بخار دهید، کاغذ را مرطوب نگه دارید و در صورت نیاز رنگ بیشتری به آن اضافه کنید. یک راه دیگر این است که لام را می توان روی یک ظرف آب جوش، بخار داد.
کاغذ خشک کن را بردارید و فیلم را با اسید الکل به مدت 1 دقیقه رنگ آمیزی کنید. سپس آن را با آب لوله کشی بشویید و با رنگ را خشک کنید.
سپس یک قطره نیگروزین را در یک سر یک لام بریزید و با کمک لام دیگری یک لایه نازک از رنگ در سراسر اسمیر ایجاد کنید.
اجازه دهید فیلم نیگروزین در هوا خشک شود.
پس از خشک شدن در هوا، لام را با استفاده از روغن ایمرسیون (Oil immersion) و میكروسكوپ نوری بررسی کنید.
سلول های رویشی بی رنگ، اندوسپورها قرمز رنگ و زمینه آن سیاه می باشد.
نمونه هایی از رنگ آمیزی اندوسپور
مثبت
کلستریدیوم پرفرنجنس (Clostridium perfringens)
کلوستریدیوم بوتولینوم (C. botulinum)
کلستریدیوم تتانی (C. tetani)
باسیلوس آنتراسیس (Bacillus anthracis)
باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)
گونه های دسولفوتوماکولوم (Desulfotomaculum)
گونه های اسپورولاکتوباسیلوس (Sporolactobacillus)
گونه های اسپوروسارسینا (Sporosarcina) و غیره.
منفی
اشریشیا کلی (E. coli)
گونه های سالمونلا (Salmonella) و غیره.
کنترل کیفیت رنگ آمیزی اندوسپور
کنترل مثبت: کلستریدیوم پرفرنجنس (ATCC 13124)
کنترل منفی: اشریشیا کلی (ATCC 25922)
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.