روش های تکنیکی پاتولوژی و تجهیزات پاتولوژی
پاتولوژی به معنای آسیب شناسی است و به مطالعه و شناسایی اختلالات عملی و تغییرات ساختاری بافت ها می‌پردازد. به طور کلی آسیب شناسی علم مطالعه بیماری هاست و به عنوان شاخه ای از علم پزشکی به بررسی علل پیدایش بیماری‌ها و عوارض ناشی از آنها می‌پردازد. بدیهی است در هنگام بروز یک بیماری، تغییراتی در بافت‌های مختلف بدن ایجاد می‌شود که در واقع مطالعه همین تغییرات مبنا و اساس پاتولوژی را تشکیل می‌دهد. بنابراین پاتولوژی علمی است که راجع به تغییرات مختلف بدن در هنگام بیماری بحث و گفتگو می‌نماید. به سازوکاری است که باعث ایجاد بیماری می‌گردد، پاتوژنزیز (pathogenesis) گفته می شود. پاتولوژی به دو گروه تشریحی و بالینی تقسیم می‌شود.
پاتولوژی چهار جنبه از یک بیماری را بررسی می‌کند که عبارت است از:
1- اتیولوژی (علت شناسی)
2- پاتوژنز (مکانیسم ایجاد)
3- مرفولوژی (ریخت شناسی)
4- اهمیت بالینی
رشته‌های پاتولوژی
1- پاتولوژی تشریحی (Anatomical): عبارت است از مطالعه تغییرات ساختاری اعم از میکروسکوپی و ماکروسکوپی و ضایعات وارده به سلول های بدن که شامل موارد ذیل می گردد:
الف- اتوپسی (نمونه برداری از بافت مرده)
ب- بیوپسی (نمونه برداری از بافت زنده)
ج- سیتوپاتولوژی (سلول شناسی)
2- پاتولوژی بالینی (Clinical): علائم بیماری را در خون، ادرار، مایع نخاعی، خلط، ترشحات واژن در بخش های مختلف میکروبشناسی، بیوشیمی، سرم شناسی و... بررسی می‌نماید.
روش تکنیکی پاتولوژی (هیستوتکنیک)
تمام مراحل کاری از ابتدای پذیرش نمونه در آزمایشگاه پاتولوژی تا آماده سازی لام و بررسی آن در زیر میکروسکوپ به عنوان روش های تکنیکی پاتولوژی در نظر گرفته می‌شود که شامل هفت مرحله جداگانه است:
1- فیکساسیون (فیکس بافت)
2- نمونه برداری یا پاس بافت
3- آبگیری و آغشتگی نمونه
4- قالب گیری بافت (امبدینگ بافت)
5- برش با میکروتوم
6- رنگ آمیزی بافت
7- مونتاژ لام و لامل
بدیهی است دقت در هر یک از مراحل فوق همراه با سرعت در اجرا لازمه تهیه یک برش میکروسکوپی مناسب و لام خوب برای تشخیص دقیق است و اشکال در هر یک از این مراحل می‌تواند سبب کاهش دقت تشخیص بیماری و به دنبال آن ایجاد اشکال در روند درمان بیمار شود.
در ادامه توضیح مختصری درباره هر یک از این مراحل داده می‌شود:
1- فیکساسیون (fixation)
این مرحله صرفاً جهت حفظ ساختار فیزیکی بافت و برای جلوگیری از اتولیز (Autolysis) آن انجام می‌شود. نمونه جراحی شده باید بلافاصله درون ماده فیکساتیو قرار بگیرد. برای این کار باید نوع بافت، درجه حرارت دوران پروسه، زمان فیکساسیون و pH محلول های به کار رفته را در نظر داشت. برای مثال مایع پایدار کننده یا فیکساتیو، باید سلول زنده را هر چه سریعتر کشته و به سرعت در بافت نفوذ نماید و در صورت امکان ساختار طبیعی سلول و بافت را تغییر ندهد و همچنین بعضی از مواد نیمه مایع و کلوئیدی را با عمل فیکساسیون تبدیل به مواد نیمه جامد (gel) کند.
در مجموع ماده فیکساتیو را باید طوری انتخاب کرد که در بافت و همچنین در رنگ آمیزی آن خللی ایجاد نکند. برای انجام این کار فیکساتیوهای مختلفی وجود دارد ولی فرمالین ۱۰% رایج ترین فیکساتیو استفاده شده می باشد. زمان ماندن نمونه در فرمالین (فرمآلدئید) بستگی به حجم و نوع نمونه دارد به طوری که هر ۴ ساعت ۷/۲ میلی متر فرمالین داخل بافت نفوذ می‌کند ولی معمولاً نمونه‌ها را ۲۴ ساعت در فرمالین نگهداری می کنند. البته لازم به ذکر است نمونه‌هایی مانند استخوان، دندان و به طور کلی بافت هایی که دارای ترکیبات آهکی باشند، باید پیش از فیکساسیون، دکلسیفیه شود تا بتوان آن را برای مراحل بعدی آماده کرد.
دکلسیفیکاسیون به معنی خارج کردن مواد معدنی مانند کلسیم از بافت استخوانی است که شامل مراحل ذیل است:
الف- تهیه نسوج
ب- فیکساسیون
ج- دکلسیفیکاسیون
د- خنثی کردن
ه- شستشو با آب
محلول دکلسیفیکاسیون باید دارای ویژگیهای ذیل باشد:
الف) کلسیم را به طور کلی از بافت آزاد کند.
ب) به بافت اصلی آسیبی وارد نکند.
ج) در رنگ آمیزی اختلال ایجاد نکند.
2- نمونه برداری یا پاس دادن بافت
برای انجام این مرحله، نمونه باید از لحاظ اندازه کاملاً مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگیری مانند گزیلول، الکل و ... نمی‌تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خیلی کوچک باشد تهیه نمونه و به دنبال آن برش و تهیه لام و... مشکل خواهد شد. برای هر کدام از نمونه‌ها باید مشخصات بافت را به طور کامل گزارش کرد. این مشخصات شامل: حالت، ابعاد، ضخامت، رنگ، ترشحات و... است. همین طور برای تفکیک نمونه‌ها از یکدیگر و شناسایی آنها باید شماره نمونه را همراه با تاریخ نمونه برداری به وسیله مداد بر روی کاغذ نوشته و همراه با بافت داخل ظروف مخصوص گذاشته و نمونه را برای مراحل بعدی آماده کرد.
3- آبگیری و آغشتگی بافت
این کار توسط دستگاهی به نام تیشو پروسسور (Tissue Processor) انجام می شود که شامل دوازده ظرف حاوی محلول های مختلف است. این محلول‌ها سه وظیفه عمده را برعهده دارند:
الف) آبگیری بافت
ب) شفاف کردن بافت
ج) آغشتگی بافت با پارافین
حجم کلی هر ظرف 1 لیتر است و ترتیب آنها بدین صورت است:
ظروف شماره ۱ و۲ حاوی فرمالین ۱۰% است. نمونه برش داده شده حدود ۳ ساعت در فرمالین قرار می گیرد. البته چنانچه این زمان بیشتر باشد اشکالی ایجاد نمی‌کند. در بعضی موارد، در ظرف شماره ۲ به جای فرمالین از آب مقطر استفاده می شود. مدت زمان قرار گرفتن نمونه در آب مقطر یک ساعت است.
ظروف سوم تا ششم شامل الکل (متانول) است، ظرف شماره ۳ الکل ۷۰% و ظرف شماره ۴ الکل ۸۰%، ظرف شماره ۵ الکل ۹۰% و ظرف شماره ۶ الکل ۹۶% است. علت صعودی انتخاب کردن این الکل‌ها این است که آب گیری به آرامی انجام شود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از این الکل‌ها یک ساعت است. به طور کلی اتانول بهتر از متانول آبگیری می‌کند ولی به علت گرانتر بودن، از متانول استفاده می شود. در عین حال متانول خاصیت رنگبری هم دارد. این مرحله بسیار مهم است و چنانچه آبگیری با الکل به خوبی انجام نشود مراحل بعدی نیز دچار اشکال شده و موجب چروکیدگی بافت‌ها خواهد شد.
ظروف شماره ۷ و 8 حاوی متانول مطلق ۱۰۰% است که در مجموع ۴ ساعت آب گیری آنها به طول می‌انجامد. ظروف ۹ و۱۰ گزیلول است که وظیفه شفاف سازی بافت و خارج کردن الکل از آنها را برعهده دارد.
ظروف شماره ۱۱ و 12 حاوی پارافین است. پارافین در دمای آزمایشگاه به صورت جامد است و باید به دمای ذوب (حدود ۶۰ درجه سانتیگراد) برسد تا ذوب شود، برای همین منظور دو ظرف آخر دارای المنتی است که باعث تولید حرارت در ظرف و ذوب شدن پارافین می‌شود. بعد از اینکه نمونه ها داخل پارافین مذاب قرار گرفت. پرافین مذاب داخل بافت ها نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگی و اشباع می رسد و پارافین کاملا در درون بافت نفوذ می کند و در دمای آزمایشگاه بافت سفت و سخت شده و قابل برش با میکروتوم خواهد شد. لازم به ذکر است که ماده آغشتگی با ماده قالب گیری باید یکی باشد.
دستگاه تیشو پروسسور دارای دکمه‌های تنظیم زمان، روشن و خاموش شدن و بالا و پائین بردن بسکت نمونه ها و چراغ هایی برای اطمینان از روشن بودن دستگاه و همچینین دکمه‌های تنظیم برنامه و تعیین مدت زمان کارکرد دستگاه است که معمولاً حدود ۱۸ ساعت طول می‌کشد که یک سیکل کامل شود.
۴- قالب گیری بافت (بلوکه کردن بافت)
برای قالب گیری بافت باید پارافین را در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد در دستگاه پارافین ذوب کن یا تیشو امبدینگ ذوب کرده و در صورت نیاز مقداری موم به نسبت ۱ به ۱۰ به آن اضافه کرد. از موم برای استحکام قالب گیری استفاده می‌شود. در صورتی که فقط از پارافین استفاده شود قالب‌ها بسیار شکننده خواهند شد. برای قالب گیری بافت باید نمونه‌های آبگیری شده را به وسیله پنس داخل ظرف مخصوص قالب گیری قرار داده، روی آن پارافین مذاب ریخت و بعد از گذشت چند دقیقه شماره نمونه‌ها را روی آنها قرار داد. این عمل اصطلاحاً بلوکه کردن بافت نامیده می‌شود و نیاز به دقت کافی دارد. برای کامل تر شدن این مرحله بلوکه های بافت تا شروع زمان برش داخل یخچال قرار می‌گیرد.
5- برش با دستکاه میکروتوم
برای انجام این کار به چند وسیله جداگانه نیاز است که این دستگاه‌ها شامل: میکروتوم، تیشو فلوت بث، چراغ مطالعه و قلم الماس است.
● میکروتوم:
دستگاهی است که از آن برای تهیه برش های نازک از بافتی که به صورت بلوک پارافینی در آمده است، استفاده می‌کنند. این دستگاه توانایی برش بافت در ضخامت‌های گوناگون را داراست. میکروتوم به طور کلی دارای دو بخش بیرونی و درونی است. در بخش درونی دستگاه، چرخ دنده‌های مختلفی تعبیه شده است که به وسیله دسته میکروتوم به چرخش در می‌آیند و میله تنظیم میکرومتر، درجه تنظیمی را به داخل منتقل می‌کند. با چرخش دسته می‌توان برش هایی به ضخامت ۱ تا 100 میکرون و حتی بالاتر تهیه کرد. قسمت بیرونی دستگاه شامل دسته گردان، گیره بلوک (کلمپ نمونه)، پیچ تنظیم زاویه بلوک، جای نگهدارنده تیغ میکروتوم (هلدر تیغ میکروتوم)، پیچ تنظیم کننده زاویه تیغ میکروتوم، درجه میکرومتر و پیچ یا دسته جلو برنده تیغ میکروتوم به وسیله دسته است. بر روی دسته، میله ای تعبیه شده که به وسیله آن می توان دسته را قفل نموده تا کاملا ثابت شود و بدین وسیله احتمال آسیب به دست یا خراب شدن بلوک کم می‌شود.
● تیشو فلوت بث (حمام شناور سازی بافت)
این دستگاه در واقع ظرفی است که درون آن آب ریخته می‌شود و قسمتی در زیر یا اطراف آن محل قرارگیری المنت گرمکن دستگاه است تا آب موجود در ظرف را به میزان دلخواه گرم نماید. به وسیله کلید کنترل کننده، دمای آب به دلخواه تنظیم می‌شود که این دما به پارافین اطراف نمونه بستگی دارد. لازم به توضیح است که داخل ظرف باید تیره باشد. بدین منظور معمولاً ظرف به وسیله تفلون پوشانده می‌شود. در واقع این دستگاه برای برطرف کردن چین و چروک بافت های برش خورده است.
● چراغ مطالعه
این وسیله بر میکروتوم و تیشو فلوت احاطه داشته و نور مناسب و کافی آن از خستگی مفرط چشم جلوگیری می‌کند.
● قلم الماس
همانطور که از نامش پیداست، برای نوشتن به کار می‌رود. نوک قلم باید از الماس باشد تا بتواند شماره نمونه‌ها را به طور خوانا روی لام که جنس شیشه دارد حک کند.
همانطور که گفته شد مرحله پنجم از هیستوتکنیک برش با میکروتوم است. در این مرحله نمونه های قالب گیری شده را به وسیله میکروتوم به ضخامت 1 تا 5 میکرون برش می‌دهند. میکروتوم موجود در آزمایشگاه‌ها معمولاً از نوع روتاری است که برای برش بهتر لازم است نمونه‌ها را حدود یک دقیقه روی یخ قرار داده شود.