پاتولوژی
پاتولوژی در لغت به معنی آسیب شناسی است و در عمل به مطالعه و شناسایی اختلالات و تغییرات ساختاری بافت ها می پردازد. به طور کلی آسیب شناسی علم مطالعه بیماری هاست و به عنوان شاخه ای از علم پزشکی به بررسی علل پیدایش بیماری ها و عوارض ناشی از آن ها می پردازد. بدیهی است در هنگام بروز یک بیماری، تغییراتی در بافت های مختلف بدن ایجاد می شود که در واقع مطالعه همین تغییرات مبنا و اساس پاتولوژی را تشکیل می دهد. بنابراین پاتولوژی علمی است که راجع به تغییرات مختلف بدن در هنگام بیماری بحث و گفتگو می کند. به ساز و کاری که باعث ایجاد بیماری می شود، پاتوژنزیز (pathogenesis) گفته می شود. پاتولوژی به دو گروه تشریحی و بالینی تقسیم می شود.
پاتولوژی چهار جنبه از یک بیماری را بررسی می کند که عبارت است از:
۱- اتیولوژی (علت شناسی)
۲- پاتوژنز (مکانیسم ایجاد)
۳- مورفولوژی (ریخت شناسی)
۴- اهمیت بالینی
رشته‌های پاتولوژی
1- پاتولوژی تشریحی (Anatomical): عبارت است از مطالعه تغییرات ساختاری اعم از میکروسکوپی و ماکروسکوپی و ضایعات وارده به سلول های بدن که شامل موارد ذیل می گردد:
الف) اتوپسی (نمونه برداری از بافت مرده)
ب) بیوپسی (نمونه برداری از بافت زنده)
ج) سیتو پاتولوژی (سلول شناسی)
2- پاتولوژی بالینی (Clinical): علائم بیماری را در خون، ادرار، مایع نخاعی، خلط، ترشحات واژن در بخش های مختلف میکروب شناسی، بیوشیمی، سرم شناسی و … بررسی می نماید.
تمام مراحل کاری از ابتدای پذیرش نمونه در آزمایشگاه پاتولوژی تا آماده سازی لام و بررسی آن در زیر میکروسکوپ به عنوان روش های تکنیکی پاتولوژی در نظر گرفته می شود که شامل هفت مرحله جداگانه است:
۱- فیکساسیون (فیکس بافت)
۲- نمونه برداری یا پاس بافت
۳- آبگیری و آغشتگی نمونه
۴- قالب گیری بافت (امبدینگ بافت)
۵- برش با میکروتوم
۶- رنگ آمیزی بافت
۷- مونتاژ لام و لامل
بدیهی است دقت در هر یک از مراحل فوق همراه با سرعت در اجرا لازمه تهیه یک برش میکروسکوپی مناسب و لام خوب برای تشخیص دقیق است و اشکال در هر یک از این مراحل می تواند سبب کاهش دقت تشخیص بیماری و به دنبال آن ایجاد اشکال در روند درمان بیماری شود.
در ادامه توضیح مختصری درباره هر یک از این مراحل داده می شود:
این مرحله صرفاً جهت حفظ ساختار فیزیکی بافت و برای جلوگیری از اتولیز (Autolysis) آن انجام می شود. نمونه جراحی شده باید بلافاصله درون ماده فیکساتیو قرار بگیرد. برای این کار باید نوع بافت، درجه حرارت پروسه، زمان فیکساسیون و pH محلول های به کار رفته را در نظر داشت. مایع پایدار کننده یا فیکساتیو، باید سلول زنده را هر چه سریع تر کشته و به سرعت در بافت نفوذ نماید و در صورت امکان ساختار طبیعی سلول و بافت را تغییر ندهد و همچنین بعضی از مواد نیمه مایع و کلوئیدی را با عمل فیکساسیون تبدیل به مواد نیمه جامد (gel) کند.
در مجموع ماده فیکساتیو را باید به گونه ای انتخاب کرد که به خود بافت آسیبی وارد نکند و همچنین در فرایند رنگ آمیزی آن خللی ایجاد نکند. برای انجام این کار فیکساتیوهای مختلفی وجود دارد ولی فرمالین 10% رایج ترین ماده فیکساتیو استفاده شده در آزمایشگاه های پاتولوژی می باشد. زمان ماندن نمونه در فرمالین (فرمالدئید) بستگی به حجم و نوع نمونه دارد به طوری که هر 2 ساعت 7/3 میلیمتر فرمالین داخل بافت نفوذ می کند ولی معمولاً نمونه ها را به مدت 24 ساعت در فرمالین نگهداری می کنند. البته لازم به ذکر است نمونه هایی مانند استخوان، دندان و به طور کلی بافت هایی که دارای ترکیبات آهکی باشند، باید پیش از فیکساسیون، دکلسیفیه شود تا بتوان آن را برای مراحل بعدی آماده کرد.
دکلسیفیکاسیون به معنی خارج کردن مواد معدنی مانند کلسیم از بافت استخوانی است که شامل مراحل ذیل است:
1- تهیه نسوج
2- فیکساسیون
3- دکلسیفیکاسیون
4- خنثی کردن
5- شستشو با آب
محلول دکلسیفیکاسیون باید دارای ویژگی های ذیل باشد:
1- کلسیم را به طور کامل از بافت خارج کند.
2- به بافت اصلی آسیبی وارد نکند.
3- در فرایند رنگ آمیزی اختلال ایجاد نکند.
۲- نمونه برداری یا پاس دادن بافت
برای انجام این مرحله، نمونه باید از لحاظ اندازه کاملاً مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگیری مانند گزیلول، الکل و … نمی تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خیلی کوچک باشد تهیه نمونه و به دنبال آن برش و تهیه لام و… مشکل خواهد شد. برای هر کدام از نمونه ها باید مشخصات بافت را به طور کامل گزارش کرد. این مشخصات شامل: حالت، ابعاد، ضخامت، رنگ، ترشحات و… است. همین طور برای تفکیک نمونه ها از یکدیگر و شناسایی آن ها باید شماره نمونه را همراه با تاریخ نمونه برداری به وسیله مداد بر روی کاغذ نوشته و همراه با بافت داخل ظروف مخصوص گذاشته و نمونه را برای مراحل بعدی آماده کرد.
آبگیری و آغشتگی بافت به پارافین توسط دستگاهی به نام تیشو پروسسور (Tissue Processor) انجام می شود که شامل 12 ظرف حاوی محلول های مختلف است. این محلول ها سه وظیفه عمده را برعهده دارند:
1- آبگیری بافت
2- شفاف کردن بافت
3- آغشتگی بافت با پارافین
حجم کلی هر ظرف در تیشو پروسسور 1 لیتر است و ترتیب آن ها به صورت ذیل است:
ظرف شماره 1 حاوی فرمالین 10% است. نمونه برش داده شده حدود 3 ساعت در ظرف فرمالین قرار می گیرد. البته چنانچه این زمان بیشتر باشد اشکالی ایجاد نمی کند. در بعضی موارد، در ظرف بعد از فرمالین از یک ظرف آب مقطر استفاده می شود. مدت زمان قرار گرفتن نمونه در آب مقطر یک ساعت است.
ظروف شماره 2 تا 7 حاوی اتانول (و یا متانول) با درصد خلوص متفاوت است، ظرف شماره 2 اتانول 70% و ظرف شماره 3 اتانول 80%، ظرف شماره 4 اتانول 90% و ظرف شماره 5 اتانول 96% است. علت صعودی انتخاب کردن این الکل ها این است که آب گیری باید به آرامی انجام شود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از این الکل ها یک ساعت است. به طور کلی اتانول بهتر از متانول آبگیری می کند ولی به علت گرانتر بودن آن، گاهی از متانول استفاده می شود. در عین حال متانول خاصیت رنگبری هم دارد. این مرحله بسیار مهم است و چنانچه آبگیری با الکل به خوبی انجام نشود مراحل بعدی نیز دچار اشکال شده و موجب چروکیدگی بافت ها خواهد شد.
ظروف شماره 6 و 7 حاوی اتانول مطلق 100% (و یا متانول) است که در مجموع 4 ساعت آب گیری در آن ها به طول می انجامد. ظروف شماره 8 و 9 حاوی گزیلول است که وظیفه شفاف سازی بافت و خارج کردن الکل از آن ها را برعهده دارد. ظروف شماره 10 و 11 و 12 حاوی پارافین است. پارافین در دمای آزمایشگاه به صورت جامد است و باید به دمای ذوب (حدود 60 درجه سانتیگراد) برسد تا ذوب شود، برای همین منظور سه ظرف آخر تیشو پروسسور دارای المنتی است که باعث گرم شدن این ظروف و ذوب شدن پارافین می شود.
بعد از اینکه نمونه ها داخل پارافین مذاب قرار گرفت. پارافین مذاب داخل بافت ها نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگی و اشباع می رسد و پارافین کاملاً در درون بافت ها نفوذ می کند و در دمای آزمایشگاه بافت ها سفت و سخت شده و قابل برش با میکروتوم می شوند. لازم به ذکر است که ماده آغشتگی با ماده قالب گیری باید یکی باشد.
دستگاه تیشو پروسسور دارای دکمه های برای تنظیم زمان، روشن و خاموش شدن آن و بالا و پائین بردن بسکت نمونه ها و چراغ هایی برای اطمینان از روشن بودن دستگاه و همچینین دکمه‌های برای تنظیم برنامه پروسس و تعیین مدت زمان کارکرد دستگاه است. در تیشو پروسسور معمولاً حدود 18 ساعت طول می کشد تا یک سیکل برنامه پروسس بافت کامل شود.
برای قالب گیری بافت باید پارافین را در دمای حدود 60 درجه سانتیگراد توسط دستگاه پارافین ذوب کن یا دستگاه تیشو امبدینگ ذوب کرد. در صورت نیاز مقداری موم به نسبت 1 به 10 به پارافین اضافه می کنند. از این موم برای استحکام بلوک های پارافینی بافت استفاده می شود. چون در صورتی که فقط از پارافین استفاده شود قالب ها شکننده خواهند شد. برای قالب گیری بافت باید نمونه های آبگیری شده را به وسیله پنس داخل ظرف مخصوص قالب گیری بافت (قالب استیل) قرار داده، روی آن پارافین مذاب ریخت و بعد از گذشت چند دقیقه اتیکت شماره نمونه ها را روی آن ها قرار داد. به این عمل اصطلاحاً بلوکه کردن بافت (امبدینگ بافت) نامیده می شود و نیاز به دقت کافی دارد. پس از تکمیل این مرحله بلوک های پارافینی بافت تا هنگام شروع برش با میکروتوم داخل یخچال نگهداری می شوند.
برای انجام این کار به چندین وسیله نیاز است که شامل: میکروتوم، تیغ میکروتوم، قلم مو، پنس، تیشو فلوت، چراغ مطالعه و قلم الماس است.
مرحله پنجم از مراحل هیستوتکنیک برش بافت با دستگاه میکروتوم است. در این مرحله نمونه قالب گیری شده را به وسیله میکروتوم به ضخامت 1 تا 15 میکرون برش می‌د هند. میکروتوم مورد استفاده در آزمایشگاه های پاتولوژی معمولاً از نوع میکروتوم روتاری است. میکروتوم دستگاهی است که از آن برای تهیه برش های نازک از بافتی که به صورت بلوک پارافینی در آمده استفاده می کنند. این دستگاه توانایی برش بافت با ضخامت های گوناگون را داراست. برای برش بهتر بافت، لازم است بلوک های بافت حدود یک دقیقه روی یخ یا سطح دستگاه کلد پلیت (صفحه سرد کننده) قرار داده شود. دستگاه میکروتوم به طور کلی دارای دو بخش بیرونی و درونی است. در بخش درونی دستگاه، چرخ دنده های مختلفی تعبیه شده است که به وسیله دسته میکروتوم به چرخش در می آیند. ولوم تنظیم میکرون، درجه تنظیمی ضخامت برش را به داخل میکروتوم منتقل می کند.
با چرخش دسته می توان برش هایی به ضخامت 1 تا 100 میکرون تهیه کرد. قسمت بیرونی دستگاه میکروتوم شامل دسته گردان، گیره بلوک (کلمپ نمونه)، پیچ تنظیم زاویه بلوک، جایگاه نگهدارنده تیغ میکروتوم (هولدر تیغ میکروتوم)، پیچ تنظیم کننده زاویه تیغ میکروتوم، ولوم درجه میکرومتر و پیچ یا دسته جلو برنده پایه تیغ میکروتوم است. بر روی دسته چرخان میکروتوم، میله ای تعبیه شده که به وسیله آن می توان دسته را قفل نمود. تا کاملاً ثابت شود و بدین وسیله احتمال آسیب به دست یا خراب شدن بلوک کم می شود.
تیشو فلوت در واقع ظرفی است که درون آن آب ریخته می شود. در زیر یا اطراف ظرف آب المنت گرمکن (هیتر) دستگاه قرار دارد تا آب موجود در ظرف را به میزان دلخواه کاربر که از قبل تنظیم کرده است گرم نماید. به وسیله دکمه های کنترل پنل حمام بافت، دمای آب به میزان دلخواه تنظیم می شود که این دما به دمای ذوب پارافین اطراف نمونه بستگی دارد. لازم به توضیح است که زیر و اطراف ظرف آب باید تیره باشد. بدین منظور معمولاً ظرف به وسیله تفلون و یا رنگ سیاه پوشانده می شود. در واقع این دستگاه برای برطرف کردن چین و چروک بافت های برش خورده است.
نور چراغ مطالعه باید بر میکروتوم و حمام شناور سازی بافت احاطه داشته باشد. باید توجه داشت نور مناسب از خستگی مفرط چشم جلوگیری می کند و باعث دقت در انجام کار می شود.
همان طوری که از نام قلم الماس مشخص است، از آن برای نوشتن به کار می رود. نوک قلم باید از جنس الماس و یا فلز سخت باشد تا بتواند شماره نمونه ها را روی لام که جنس شیشه ای دارد حک کند.