رنگ آمیزی اسید فست به روش زیل نلسونرنگ آمیزی اسید فست-زیل نلسون
رنگ آمیزی زیل نلسون، متداول‌ترین روش رنگ آمیزی در آزمایشگاه های مایکوباکتریولوژی برای باکتری های اسید فست مانند مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (TB) است. ارگانیسم های مایکوباکتریوم و نوکاردیا به دلیل داشتن مقدار زیادی لیپید و اسید مایکولیک در دیواره خود با روش رنگ آمیزی گرم به سختی به صورت گرم + ظاهر شده و یا رنگ نمی گیرند. از آنجا که مایکوباکتریوم با قرار گیری در معرض محلول های اسیدی رنگ را درون خود حفظ می کنند آن را در دسته باکتری های اسید فست قرار میدهند. از این باکتری‌ها مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (عامل سل) و مایکوباکتریوم لپره (عامل جذام) از همه معروف ترند. برای رنگ آمیزی زیل نلسون از سه محلول کربول فوشین، اسید الکل برای رنگ بری و متیلن بلو (رنگ زمینه) استفاده می کنیم. باکتری اسید فست به رنگ قرمز روشن و زمینه آبی کمرنگ می شود.
مایکوباکتریوم ها باکتری های هوا دوست و باسیلی شکل هستند که همانگونه که گفته شد به راحتی رنگ نمی گیرند اما زمانی که رنگ گرفتند در برابر از دست دادن رنگ خود به وسیله اسید یا الکل مقاومت می کنند، بنابراین باسیل های مقاوم به اسید یا اسیدفست نامیده می شوند. روش رنگ آمیزی زیل نلسون تکنیکی است که جهت رنگ آمیزی گونه های مایکوباکتریوم از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم اولسرانس و مایکوباکتریوم لپره استفاده می شود.
در این مطلب قصد داریم تا شما را با تکنیک رنگ آمیزی زیل نلسون، مواد و محلول های مورد استفاده در این روش و همچنین نحوه بررسی نتایج حاصل از آن آشنا کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
۱. آشنایی با تکنیک رنگ‌آمیزی زیل نلسون
روش رنگ آمیزی زیل نلسون یک روش رنگ آمیزی افتراقی است که ابتدا توسط شخصی به نام زیل Ziehl ساخته شد و بعداً توسط فردی به نام نلسون Neelsen اصلاح گردید. از این رو این تکنیک را با نام زیل نلسون می شناسند.
مایکوباکتریوم، اکتینومایسس (Actinomycetes)، نوکاردیا (Norcadia)، ایزوسپورا (Isospora)، کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium) و برخی قارچ ها دارای دیواره سلولی ضخیمی هستند که از کمپلکس های لیپوئیدی به نام اسید مایکولیک تشکیل شده‌اند. اسید مایکولیک باعث می‌شود تا دیواره سلولی، مومی، آبگریز و نفوذ ناپذیر شود. به همین دلیل رنگ آمیزی اسید مایکولیک دشوار است.
در تکنیک رنگ‌آمیزی زیل نلسون از فوشین بازی (basic fuchsin) و فنول (phenol) برای رنگ‌آمیزی دیواره سلولی گونه‌های مایکوباکتریوم استفاده می‌شود. همانطور که گفته شد مایكوباكتریوم به راحتی رنگ نمی‌گیرد. بنابراین استفاده از گرما همراه با كربول فوشین و فنول باعث نفوذ رنگ به دیواره سلول باكتری خواهد شد. کربول فوشین که خاصیت بازی دارد به اجزای منفی باکتری ها متصل می‌شود که شامل اسید مایکولیک و دیواره سلول لیپیدی است.
از کاربردهای روش رنگ‌آمیزی زیل نلسون می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
شناسایی و تشخیص گونه های مایکوباکتریوم از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم لپرا
افتراق باسیل های اسید فست و غیر اسید فست
شناسایی برخی از گونه های قارچ مانند کریپتوسپوریدیوم
توجه: رنگ آمیزی مایکوباکتریم‌ها را می‌توان به ۲ صورت زیر انجام داد.
۱. روش زیل نلسون داغ: در این روش رنگ فنول-کربول فوشین گرم می شود تا رنگ بتواند به دیواره سلول مایکوباکتریوم مومی نفوذ کند.
۲. روش سرد: در این تکنیک که به رنگ آمیزی کانیون (Kinyoun Method) نیز معروف است، رنگ گرم نمی شود بلکه با افزایش غلظت فوشین و فنول بازی و استفاده از یك ماده شیمیایی، نفوذ رنگ به دیواره سلولی حاصل خواهد شد.
۲. نمونه مورد نیاز
از آنجایی که در طول شب، ترشحات (به عنوان مثال خلط) انباشته می شوند، نمونه‌‌ای که در صبح جمع آوری شود ارجحیت دارد.
برای آماده سازی لام نیز ممکن است اسمیر به دو صورت تهیه شود:
۱. اسمیر مستقیم (Direct Smear): اسمیر قبل از پردازش مستقیماً از نمونه بیمار تهیه می شود.
۲. اسمیر غیرمستقیم (Indirect Smear): اسمیر از یک نمونه‌ی پردازش شده پس از سانتریفیوژ کردن تهیه شده است.
۳. مواد و محلول های مورد استفاده
۱-۳. کربول فوشین
آب مقطر …………………………………………… ۱۰۰ میلی‌لیتر
فوشین بازی ……………………………………….. ۱ گرم
الکل اتیل (اتانول۱۰۰٪) ………………….. ۱۰ میلی‌لیتر
فنول کریستال…………………………………… ۵ میلی‌لیتر
۲-۳. اسید الکل (هیدروکلریک اسید ۳٪ در اتیل الکل ۹۵ ٪)
اتیل الکل ……………………………………… ۹۵ میلی لیتر
آب مقطر……………………………………….. ۲ میلی لیتر
هیدروکلریک اسید غلیظ ……………… ۳ میلی لیتر
از اسید الکل جهت رنگ زدایی استفاده می شود. به جای آن می‌توان از اسید سولفوریک ۲۰٪ نیز استفاده کرد.
۳-۳. متیلن بلو ۰/۲۵٪ در اسید استیک ۱٪
متیلن بلو …………………………. ۰/۲۵ گرم
آب مقطر …………………………… ۹۹ میلی لیتر
اسید استیک ……………………… ۱ میلی لیتر
می‌توان مالاشیت گرین (۵ گرم در لیتر) را جایگزین متیلن بلو کرد.
۴. مراحل رنگ آمیزی به روش زیل نلسون
ابتدا اسمیری از کشت نمونه را روی یک لام میکروسکوپ تمیز و استریل قرار دهید.
فیکس کردن اسمیر به کمک حرارت
اسمیر را به کمک حرارت فیکس کنید. توجه داشته باشید که این کار باید با قسمت آبی رنگ شعله انجام شود.
کربول فوشین را روی اسمیر بریزید به طوری که کاملاً اسمیر را پوشش دهد. در این مرحله و برای رنگ گرفتن ارگانیسم لازم است تا کربول فوشین را حرارت دهید. به این منظور ابتدا یک پنبه را به الکل آغشته کرده و آن را شعله ور کنید. پنبه را زیر لام گرفته و لام را به آرامی حرارت دهید تا بخار ایجاد شود. هنگام ایجاد بخار پنبه را از زیر لام بردارید. با قطع شدن بخار، مجدداً پنبه را زیر لام قرار دهید. این کار را به مدت ۵ دقیقه انجام دهید. توجه داشته باشید که از حرارت دادن بیش از حد لام خودداری کنید و مراقب باشید رنگ نجوشد.
پس از گذشت ۵ دقیقه، لام را به آرامی با آب شیر بشویید.
اسید سولفوریک ۲۰٪ را روی لام بریزید و ۱ الی ۲ دقیقه صبر کنید. این مرحله را تکرار کنید تا جایی که اسمیر صورتی شود.
اسید را با آب بشویید.
متیلن بلو را روی لام بریزید به طوری که کاملاً اسمیر را بپوشاند. پس از گذشت ۲ الی ۳ دقیقه لام را با آب بشویید.
اجازه دهید لام در دمای اتاق خشک شود و سپس آن را به کمک عدسی ایمرسیون بررسی کنید.
۵. بررسی نتایج رنگ‌آمیزی زیل نلسون
باکتری های اسید فست………..صورتی
باکتری های غیر اسیدفست……..آبی
۶. جمع بندی
همانطور که در قسمت های قبلی نیز به آن اشاره شد، روش رنگ آمیزی زیل نلسون یکی از تکنیک های بسیار کاربردی در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی است که جهت بررسی و تشخیص ارگانیسم هایی به کار می رود که با استفاده از تکنیک هایی مانند رنگ آمیزی گرم، قابل تشخیص نیستند. مایکوباکتریم‌ها از این قبیل میکروارگانیسم‌ها هستند.
لازم به ذکر است که برای رنگ آمیزی اسید فست دو روش وجود دارد:
۱. روش های کربول فوشین که شامل تکنیک زیل نلسون و کانیون است.
۲. روش فلوروکروم با استفاده از رنگ‌های O- اورامین (auramine-O) یا اورامین-رودامین (auramine-rhodamine)