رنگ‌آمیزی ورهوف
روش رنگ آمیزی ورهوف (Verhoeff) که به عنوان تکنیک Verhoeff-van Gieson نیز شناخته می شود، یک روش رنگ آمیزی در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی است که توسط شخصی به نام فردریک هرمان ورهوف در سال ۱۹۰۸ میلادی ایجاد شد. از این تکنیک برای رنگ آمیزی نمونه بافت های غضروف کشسان (الاستیک)، ریه ها، پوست، مثانه و برخی رباط ها استفاده می شود.
در این مطلب قصد داریم به بررسی این تکنیک رنگ‌امیزی و مواد و محلول‌های مورد استفاده در آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
چرا برای رنگ آمیزی بافت الاستیک از تکنیک ورهوف استفاده می شود؟
برای پاسخ به این سوال ابتدا باید مروری بر رنگ های روتین و خاص در آزمایشگاه داشته باشیم.
در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی، اصطلاح “رنگ آمیزی روتین” به رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) اطلاق می شود که به طور “روتین” برای آشکار سازی ساختار یک بافت در اکثر نمونه های بافتی مورد استفاده قرار می گیرد.
در مقابل رنگ های خاص به دسته ای از رنگ های آزمایشگاهی گفته می شود که به کمک آن ها می توان گروه خاصی از ارگانیسم ها یا نمونه های بافت را بررسی کرد. این رنگ ها اغلب زمانی مورد استفاده قرار می گیرند که تکنیک رنگ آمیزی H&E تمام اطلاعات مورد نیاز آسیب شناس یا محقق را فراهم نکند.
بررسی الاستین (Elastin) یکی از این موارد خاص است. الاستین پروتئینی است که فیبرهای الاستیک موجود در بافت همبند را می سازد. فیبر الاستین به واسطه آنزیمی به نام لیزیل اکسیداز به هم متصل می شوند و یک ماتریس الاستین منشعب و سه بعدی ایجاد می کنند که به انعطاف پذیری بافت کمک می کند. الاستین معمولاً در پوست و دیواره رگ های خونی یافت می شود و این توانایی را دارد که پس از کشش، مجدد به حالت اولیه خود باز گردد. بررسی الاستین با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسلین ائوزین کار چندان راحتی نیست. بنابراین نیاز به رنگ آمیزی خاص دارد. آسیب شناسان ممکن است برای تشخیص سندرم مارفان، آمفیزم و آرتریت سلولی غول آسا (غول پیکر) فیبر الاستیک را مورد بررسی قرار دهند. یکی از رنگ های خاصی که برای رنگ آمیزی و بررسی فیبر الاستیک مورد استفاده قرار می‌گیرد، تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف است. اگرچه رنگ‌های خاص مختلفی برای شناسایی الیاف الاستیک وجود دارد (به عنوان مثال آلدهید فوشین [۳])، اما رنگ‌آمیزی ورهوف بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد زیرا سریع است و باعث ایجاد تمایز شدید الیاف الاستیک می شود.
مواد و محلول های مورد استفاده در روش رنگ آمیزی ورهوف
در ادامه این مطلب به بررسی مواد و محلول های مورد استفاده در رنگ‌آمیزی ورهوف و نحوه آماده سازی آن‌ها خواهیم پرداخت.
۱. فیکساتیو:
بافر فرمالین خنثی ۱۰%.
۲. نمونه:
قطعات پارافین گیری شده که به ضخامت ۵ میکرومتر برش خورده اند.
۳. هماتوکسیلین الکلی ۵%
کریستال های هماتوکسیلین (C.I. 75290) ———————- ۵٫۰ گرم
الکل ۸۰% ——————————————————–۱۰۰٫۰ میلی‌لیتر
۴. کلرید آهن۱۰٪
کلرید آهن(FeCl3 ∙ ۶H20) ———————————- ۱۰٫۰ گرم
آب مقطر ——————————————————–۱۰۰٫۰ میلی‌لیتر
۵. محلول ید لوگول
یدید پتاسیم —————————————————–۴٫۰ گرم
ید —————————————————————- ۲٫۰ گرم
آب مقطر ———————————————————۱۰۰٫۰ میلی‌لیتر
نحوه آماده سازی: یدید پتاسیم را کمی در آب مقطر حل کرده و سپس ید را اضافه نمایید و حل کنید. در نهایت باقی مانده آب مقطر را اضافه کنید.
۶. محلول رنگ آمیزی ورهوف
هماتوکسیلین الکلی ۵% —————————————-۲۰٫۰ میلی‌لیتر
کلرید آهن ۱۰% ———————————————–۱۰٫۰ میلی‌لیتر
ید لوگول ——————————————————۱۰٫۰ میلی‌لیتر
۷. کلرید آهن ۲٪
کلرید آهن ۱۰% (FeCl3 ∙ ۶H20) ————————— ۱۰٫۰ گرم
آب مقطر —————————————————–۴۰٫۰ میلی‌لیتر
۸. لکه ون گیسون
اسید فوشین (C.I. 42685)ء ———————————– ۰٫۱ گرم
اسید پیکریک اشباع (تقریباً ۱٫۴٪) ————————– ۱۰۰٫۰ میلی‌لیتر
مراحل رنگ‌آمیزی ورهوف
روش رنگ آمیزی ورهوف دو مرحله اصلی دارد:
بخش رنگ آمیزی ورهوف: در این مرحله یک رنگ حاوی آهن و هماتوکسیلین که مخصوص الیاف الاستیک است، با الاستین پیوندهای قوی ایجاد می کند.
بخش رنگ آمیزی ون گیسون: در این مرحله لام با استفاده از ضد لکه ای که مخصوص کلاژن است، رنگ‌آمیزی می شود. به مراحل رنگ‌آمیزی ورهوف که در ادامه ذکر شده است توجه کنید:
۱. پارافین‌زدایی و هیدراسیون بافت را انجام دهید.
۲. لام را به مدت ۱۰ دقیقه در محلول رنگ آمیزی ورهوف قرار دهید. پس از گذشت ۱۰ دقیقه ابتدا لام را برای چند ثانیه زیر شیر آب نگه دارید و سپس دو مرتبه در آب مقطر فرو برده و خارج کنید.
۳. جهت ایجاد تمایز، لام را به مدت ۱۵ ثانیه در کلرید آهن ۲% قرار دهید و مجددا آن را دو مرتبه در جار حاوی آب مقطر فرو برده و خارج کنید.
۴. فیبر الاستیک را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. در این مرحله باید فیبرهای سیاه با پس زمینه خاکستری مشاهده کنید. در غیر این صورت مرحله ۳ را مجدد تکرار کنید.
۵. لام را به مدت ۱ دقیقه در محلول ون گیسون قرار دهید. اما اجازه ندهید لام درون محلول باقی بماند. بلکه به حالت ضربه‌ای لام را درون جار رنگ آمیزی حاوی محلول ون گیسون حرکت دهید.
۶. بافتِ روی لام را با درجات مختلف الکل دهیدراته کرده و شفاف سازی با زایلن را انجام دهید.
۷. در نهایت لامل را به کمک رزین مصنوعی روی لام قرار داده و نتایج را زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
نتایج رنگ آمیزی فیبر الاستیک با روش رنگ آمیزی ورهوف
فیبر الاستیک ——————- مشکی
هسته ————————– آبی متمایل به مشکی
کلاژن ————————– قرمز
سایر عناصر بافت —————- زرد
چه کسانی از روش رنگ‌آمیزی ورهوف استفاده می کنند؟
رنگ‌آمیزی ورهوف به طور گسترده هم برای اهداف تشخیصی و هم برای اهداف تحقیقاتی کاربرد دارد.
در آزمایشگاه‌های تشخیصی، تکنیک ورهوف برای شناسایی وجود یا عدم وجود الیاف الاستیک در بافت ها مورد استفاده قرار می گیرد.
به عنوان مثال، پاتولوژیست ممکن است از این روش برای بررسی میزان از بین رفتن بافت الاستیک در ریه بیماران مبتلا به آمفیزم استفاده کند و یا از رنگ آمیزی ورهوف جهت بررسی نازک شدن فیبر الاستیک در عروق خونی بیماران مبتلا به تصلب شرایین بهره ببرد.
محققان نیز ممکن است در پروژه های تحقیقاتی خود روی بیماری های مختلف از رنگ آمیزی ورهوف برای تمایز بافت همبند در نمونه استفاده کنند.