رنگ آمیزی وان کوزا (Von Kossa)
مقدمه ای در مورد رنگ آمیزی وان کوزا در بافت شناسی
رنگ آمیزی وان کوزا (Von Kossa) به طور گسترده در بافت شناسی برای تشخیص وجود رسوبات غیرطبیعی کلسیم در بدن استفاده می‌ شود، به همین علت با عنوان رنگ کلسیم (Calcium Stain) نیز شناخته شده است. اصل این رنگ‌ آمیزی مبتنی بر تبدیل نمک‌ های کلسیم به نمک‌ های نقره است: یون‌ های کلسیم، متصل به فسفات‌ ها، با یون‌ های نقره که با محلول نیترات نقره آورده می‌ شوند، جایگزین می‌ شوند. فسفات های نقره که در زیر یک منبع نور قرار می گیرند، دچار تخریب فتوشیمیایی می شوند که منجر به مشاهده رسوبات فلزی نقره می‌ شود.

تاریخچه رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا
بیش از یک قرن پیش، پزشک مجارستانی جولیوس وان کوزا (Julius von Kossa) یک روش رنگ‌ آمیزی کلاسیک را برای تشخیص رسوبات معدنی در بافت‌ های حیوانی ابداع کرد. از آن زمان، این روش به طور گسترده استفاده شده و با ضد رنگ‌ های مختلف ترکیب شده است. وان کوزا در یکی از اولین تحقیقات خود، بخش هایی از کلیه را با محلول های ۱ تا ۵ درصد نیترات نقره تیمار کرد که منجر به رنگ زرد رسوبات کلسیم شد. این رنگ موقت بود و به تدریج از رنگ خاکستری به سیاه تغییر کرد. برای نشان دادن یافته‌ های خود، او تصویری از کلیه اسب مسموم شده با سولفات مس ارائه داد.

انواع کاربردهای رنگ آمیزی  وان کوزا در بافت شناسی
این رنگ برای تشخیص کلسینوز (Calcinosis) مانند کندروکلسینوز (Chondrocalcinosis)، نفروکلسینوز (Nephrocalcinosis)، کلسینوز جلدی (Cutaneous Calcinosis) مفید است. همچنین می‌ توان از آن برای تشخیص کلسیفیکاسیون در تومورها استفاده کرد.
سنجش میزان رسوب کلسیم داخل سلولی به روش رنگ‌ سنجی در تمایز سلولهای مزانشیمی به استئوبلاست نیز با رنگ آمیزی وان کوزا انجام می‌ شود.

نگاهی اجمالی به کلسیم رنگ شده با وان کوزا
کلسیم برای همه موجودات زنده ضروری است، جایی که جداسازی و انتشار Ca2+ در داخل و خارج سیتوپلاسم به عنوان یک سیگنال برای بسیاری از فرآیندهای سلولی عمل می‌ کند. ۹۹ درصد کلسیم در استخوان‌ ها و دندان‌ ها و ۱ درصد باقیمانده در خون و بافت نرم یافت می‌ شود. سطح کلسیم سرم به شدت کنترل می‌ شود (۸.۴-۱۱.۴ میلی گرم در دسی لیتر) و هر گونه تغییر خارج از این محدوده می‌ تواند اثرات جدی داشته باشد. کلسیم در انقباض و شل شدن عروق خونی، انتقال پالس‌ های عصبی، انقباض عضلانی و ترشح هورمون نقش دارد. کانال‌ های یون کلسیم، مهاجرت یون‌ های کلسیم را در غشای سلولی کنترل می‌ کنند و امکان فعال‌ سازی و مهار طیف وسیعی از آنزیم‌ ها را فراهم می‌ کنند. علل سطوح پایین کلسیم عبارتند از نارسایی مزمن کلیه، کمبود ویتامین D و سطوح پایین منیزیم خون که می‌ تواند در اعتیاد شدید به الکل رخ دهد.

انواع نمونه‌ های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌ آمیزی وان کوزا
رنگ آمیزی وان کوزا را می توان روی انواع بافت هایی که ممکن است دارای رسوب غیرطبیعی کلسیم باشند استفاده کرد. اغلب بافت هایی مانند مفاصل، رگ‌های خونی و کلیه‌ها می‌ توانند جز این موارد هستند.

در این مقاله به یکی از پروتکل های ستاپ شده رنگ آمیزی وان کوزا می‌ پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی وان کوزا در بافت‌ شناسی
در این پروتکل برای رنگ آمیزی هسته سلولها و سیتوپلاسم، از رنگ Nuclear red استفاده می شود.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌ آمیزی  وان کوزا
پس از جدا نمودن بافت مورد نظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت­ها را در فرمالین ده درصد فیکس می­ کنیم.
در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت­ها قرارداده و نام یا کد نمونه ­ها را روی تیشو بسکت‌ ها می نویسیم.
آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه ­‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با غلظت‌ ­های افزایشی اتانول این مرحله انجام می­ شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می­گردد.
قالب­گیری بافت: بلوک‌ ­های پارافینی از نمونه‌­های بافتی با استفاده از دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ و پارافین جامد انجام می­دهیم.
برش ­گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب ­‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش ­‌های نازک در حد ۵ الی ۱۰ میکرومتر تهیه می کنیم.
آبدهی نمونه برش­‌زده: برش‌­ های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می­ کنیم.
اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌­آمیزی رنگ می­ کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی وان کوزا
لام های آماده شده را در محلول ۵% نقره نیترات یا محلول رنگی وان کوزا شناور می کنیم.
لام ها را در معرض نور طبیعی یا لامپ UV به مدت ۲۰ دقیقه قرار می‌ دهیم و پس از آن لام‌ها را با آب مقطر شستشو می‌ دهیم.
لام ها را در محلول سدیم تیوسولفات ۲ درصد به مدت ۲ دقیقه انکوبه می کنیم و با جریان آب شستشوی مختصر می‌ دهیم.
نمونه های بافتی را اکنون با محلول رنگی ۱% Nuclear red به مدت ۲ دقیقه تیمار نموده و سریعا دهیدراته می کنیم.
پس از خشک شدن لام‌ها، با چسب انتلان و لامل نمونه‌ها را مونت کرده و با میکروسکوپ فلورسنت بررسی می‌ کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا
مواد مورد نیاز

اتانول مطلق
پارافین
آب مقطر
فرمالین ده درصد
چسب انتلان
نقره نیترات
لامپ UV
سدیم تیوسولفات
Nuclear red  
 

تجهیزات مورد نیاز

میکروسکوب 
دستگاه میکروتوم و تیغ میکروتم
دستگاه گرمکن اسلاید بافتی (هات پلیت)
دستگاه پارافین دیسپنسر 
دستگاه تیشو امبدینگ
لام و لامل

تفسیر نتایج رنگ آمیزی وان کوزا
تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا یک واکنش دو مرحله‌ای است: اول، کاتیون‌ های نقره با اجزای رسوبات کلسیم واکنش می‌ دهند که منجر به رنگ زرد ناپایدار می‌ شود، در حالی که در مرحله دوم، مواد آلی نقره متصل شده را به نقره فلزی سیاه با کمک نور تغییر می‌ دهند. Nuclear red اجازه می دهد تا هسته سلول‌ ها به رنگ قرمز و سیتوپلاسم آنها به رنگ صورتی رنگ‌ آمیزی شود. یکی از روش های تشخیص انواع کلسینوز در پاتولوژی، رنگ آمیزی وان کوزا است به عنوان مثال در کلسینوز دستگاه گوارش از جمله کلسینوز مخاط مری که یک بیماری نادر است رسوبات کلسیمی به راحتی قابل شناسایی است.
در برخی از پروتکل ها، علاوه بر اینکه رسوبات کلسیمی، به رنگ سیاه مشاهده می شود، کلاژن و استئوید (Osteoid) نیز قرمز رنگ می شوند که سبب تشخیص و بررسی دقیق‌تر نمونه بافتی می شود.

جمع بندی
کلسیفیکاسیون بافت در مشکلات فرآیندهای متابولیکی بدن و در تومورها نیز نقش بسزایی دارد. بنابراین تکنیک‌ های معتبر بررسی رسوبات کلسیم به تشخیص دقیق پزشکی و تحقیقاتی پاتولوژی کمک می‌ کند. همانطور که توضیح داده شد یکی از این تکنیک ها، رنگ آمیزی وان کوزا در آزمایشگاه پاتولوژی است که به بررسی کلسیم در نمونه بافتی می پردازد.

سوالات متداول
❔ رنگ آمیزی وان کوزا برای چه مواردی در آزمایشگاه پاتولوژی استفاده می شود؟
✔️ رنگ آمیزی وان کوزا به طور گسترده در بافت شناسی برای تشخیص وجود رسوبات غیر طبیعی کلسیم در بدن استفاده می شود.

❔ اساس تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا در بافت شناسی چیست؟
✔️ اصل این رنگ‌ آمیزی مبنی بر تبدیل نمک‌ های کلسیم به نمک‌ های نقره است: یون‌ های کلسیم، متصل به فسفات‌ ها، با یون‌ های نقره در محلول نقره نیترات جایگزین می‌ شوند و نهایتاً رسوبات کلسیمی به رنگ سیاه حاصل می شود.