مراحل آماده‌سازی نمونه بافت در آزمایشگاه پاتولوژی؛ از فیکساسیون تا رنگ‌آمیزی

آماده‌سازی نمونه بافت در آزمایشگاه پاتولوژی یکی از مهم‌ترین فرآیندها برای بررسی دقیق ساختار سلولی و بافتی زیر میکروسکوپ است. کیفیت نمونه از زمان دریافت و فیکساسیون تا پردازش بافت، قالب‌گیری با پارافین، برش‌گیری و رنگ‌آمیزی، می‌تواند بر کیفیت اسلاید نهایی تأثیرگذار باشد.

در این مقاله، مراحل آماده‌سازی بافت در پاتولوژی را به‌صورت مرحله‌به‌مرحله بررسی می‌کنیم و با تجهیزات و مواد مصرفی مورد استفاده در هر مرحله آشنا می‌شویم.

آماده‌سازی نمونه بافت چیست؟

آماده‌سازی نمونه بافت یا Tissue Processing مجموعه‌ای از فرآیندهای آزمایشگاهی است که با هدف آماده کردن بافت برای تهیه مقاطع نازک و بررسی میکروسکوپی انجام می‌شود.

بافت تازه معمولاً نرم و دارای مقدار زیادی آب است و نمی‌توان آن را مستقیماً با میکروتوم برش داد. به همین دلیل، نمونه باید طی مجموعه‌ای از مراحل آماده شود تا ساختاری مناسب برای قالب‌گیری و برش‌گیری پیدا کند.

به‌طور معمول، مراحل آماده‌سازی نمونه بافت شامل موارد زیر است:

1. دریافت و شناسایی نمونه
2. فیکساسیون بافت
3. بررسی ماکروسکوپی و انتخاب نمونه
4. قرار دادن نمونه در کاست بافت
5. آب‌گیری
6. شفاف‌سازی
7. نفوذ پارافین
8. قالب‌گیری در پارافین
9. برش‌گیری با میکروتوم
10. انتقال مقطع روی لام
11. رنگ‌آمیزی
12. نصب لامل و آماده‌سازی اسلاید نهایی

۱. دریافت و شناسایی نمونه پاتولوژی

فرآیند آماده‌سازی نمونه از زمان ورود نمونه به آزمایشگاه آغاز می‌شود. نمونه ممکن است حاصل بیوپسی، جراحی یا سایر روش‌های نمونه‌برداری باشد.

در این مرحله، مشخصات نمونه با اطلاعات ثبت‌شده مطابقت داده می‌شود. نوع نمونه، محل برداشت، مشخصات بیمار و اطلاعات درخواست آزمایش باید به‌درستی ثبت و قابل پیگیری باشد.

شناسایی صحیح نمونه یکی از مهم‌ترین اصول کنترل کیفیت در آزمایشگاه پاتولوژی است.

برای نگهداری و انتقال نمونه، استفاده از ظروف نمونه پاتولوژی مناسب نیز اهمیت دارد.

۲. فیکساسیون نمونه بافت

پس از دریافت نمونه، معمولاً مرحله فیکساسیون بافت (Tissue Fixation) انجام می‌شود. هدف فیکساسیون، حفظ ساختار بافت و سلول‌ها و جلوگیری از تغییرات ناشی از تجزیه نمونه است.

یکی از فیکساتیوهای رایج در آزمایشگاه‌های پاتولوژی، فرمالین بافر خنثی ۱۰ درصد است.

مواردی مانند اندازه نمونه، حجم فیکساتیو، زمان تماس و شرایط نگهداری می‌توانند بر کیفیت فیکساسیون اثر داشته باشند.

فیکساسیون نامناسب ممکن است کیفیت مورفولوژی بافت را کاهش داده و مراحل بعدی مانند پردازش، برش‌گیری و رنگ‌آمیزی را با مشکل مواجه کند.

محصولات مرتبط با این مرحله

در این بخش از فرآیند معمولاً به محصولاتی مانند:

• ظروف نمونه پاتولوژی
• ظروف مخصوص نگهداری نمونه
• فرمالین و سایر فیکساتیوهای مورد استفاده آزمایشگاه
• لیبل و تجهیزات شناسایی نمونه

نیاز است.

۳. بررسی ماکروسکوپی و Grossing

پس از فیکساسیون، نمونه توسط فرد متخصص از نظر ظاهری بررسی می‌شود. این مرحله با عنوان Gross Examination یا Grossing شناخته می‌شود.

در بررسی ماکروسکوپی، ویژگی‌هایی مانند اندازه، شکل، رنگ و سایر مشخصات ظاهری نمونه مورد توجه قرار می‌گیرد.

سپس قسمت‌های مناسب نمونه برای پردازش انتخاب شده و در کاست بافت (Tissue Cassette) قرار می‌گیرند.

کاست بافت چیست؟

کاست بافت محفظه‌ای مخصوص برای نگهداری نمونه در مراحل مختلف پردازش بافت است. طراحی مناسب کاست باعث می‌شود نمونه در طول فرآیند پردازش قابل شناسایی و جابه‌جایی باشد.

اگر در آزمایشگاه به‌صورت روزانه تعداد زیادی نمونه پردازش می‌شود، کیفیت و سازگاری کاست پاتولوژی با تجهیزات آزمایشگاه اهمیت ویژه‌ای پیدا می‌کند.

۴. آب‌گیری بافت؛ Dehydration

یکی از مراحل مهم پردازش بافت در پاتولوژی، آب‌گیری یا Dehydration است.

بافت حاوی آب است و برای ورود پارافین باید آب آن به‌تدریج خارج شود. این فرآیند معمولاً با استفاده از غلظت‌های افزایشی الکل انجام می‌شود.

آب‌گیری بیش از حد یا ناکافی می‌تواند روی کیفیت بافت و مراحل بعدی اثر بگذارد. به همین دلیل، انتخاب برنامه مناسب در دستگاه تیشو پروسسور (Tissue Processor) اهمیت زیادی دارد.

۵. شفاف‌سازی بافت؛ Clearing

بعد از آب‌گیری، ماده‌ای که برای خارج کردن آب از نمونه استفاده شده باید با ماده‌ای مناسب برای مرحله نفوذ پارافین جایگزین شود.

این فرآیند شفاف‌سازی یا Clearing نام دارد.

در روش‌های رایج، زایلن یا مواد جایگزین آن می‌توانند برای این مرحله مورد استفاده قرار گیرند. انتخاب ماده مناسب باید بر اساس پروتکل آزمایشگاه، نوع نمونه و دستورالعمل ایمنی انجام شود.

۶. نفوذ پارافین به بافت

در مرحله بعد، پارافین مذاب وارد ساختار بافت می‌شود و جایگزین ماده شفاف‌کننده می‌گردد.

پس از سرد شدن پارافین، بافت استحکام کافی برای قالب‌گیری و تهیه مقاطع نازک پیدا می‌کند.

کیفیت پارافین مورد استفاده می‌تواند روی قالب‌گیری و برش‌گیری تأثیر داشته باشد. به همین دلیل، انتخاب پارافین پاتولوژی مناسب یکی از موارد مهم در آزمایشگاه‌های بافت‌شناسی است.

۷. قالب‌گیری بافت در پارافین

پس از نفوذ پارافین، نمونه در قالب مخصوص قرار گرفته و بلوک پارافینی ساخته می‌شود.

این مرحله را Tissue Embedding می‌نامند.

در قالب‌گیری، جهت قرارگیری نمونه اهمیت زیادی دارد؛ زیرا نحوه قرارگیری بافت تعیین می‌کند که در زمان برش‌گیری چه سطحی از نمونه در معرض تیغه قرار بگیرد.

تجهیزات مورد نیاز برای قالب‌گیری

برخی از ملزومات این مرحله عبارت‌اند از:

• پارافین پاتولوژی
• قالب‌های Embedding
• کاست بافت
• ایستگاه قالب‌گیری پارافین
• تجهیزات گرم‌کننده و سردکننده مرتبط

۸. برش‌گیری بافت با میکروتوم

پس از آماده شدن بلوک پارافینی، نوبت به برش‌گیری بافت می‌رسد.

برای تهیه مقاطع بسیار نازک از بلوک پارافینی از دستگاه میکروتوم (Microtome) استفاده می‌شود.

تیغه میکروتوم لایه‌هایی نازک از بلوک ایجاد می‌کند تا مقطع برای انتقال به لام و رنگ‌آمیزی آماده شود.

چه عواملی بر کیفیت برش میکروتوم تأثیر دارند؟

کیفیت برش به عوامل مختلفی وابسته است، از جمله:

• کیفیت بلوک پارافینی
• نوع و کیفیت تیغه
• تنظیم صحیح میکروتوم
• دمای بلوک
• ویژگی‌های بافت
• مهارت کاربر

به همین دلیل، استفاده از تیغ میکروتوم با کیفیت مناسب یکی از نکات مهم در فرآیند برش‌گیری نمونه‌های بافتی است.

۹. انتقال مقطع روی لام میکروسکوپی

مقطع ایجادشده توسط میکروتوم باید روی لام میکروسکوپی منتقل شود.

مقطع معمولاً روی حمام آب قرار می‌گیرد تا چین‌خوردگی‌های آن کاهش پیدا کند و سپس با دقت روی لام قرار داده می‌شود.

در این مرحله باید از ایجاد چین، پارگی یا جابه‌جایی مقطع جلوگیری شود.

برای برخی کاربردها، استفاده از لام چسب‌دار یا Charged Slide می‌تواند به چسبندگی بهتر مقطع کمک کند.

۱۰. رنگ‌آمیزی نمونه بافت

پس از انتقال مقطع روی لام، نمونه برای رنگ‌آمیزی آماده می‌شود.

یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌های رنگ‌آمیزی در پاتولوژی، رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) است.

رنگ‌آمیزی H&E به ایجاد کنتراست مناسب بین ساختارهای سلولی و بافتی کمک می‌کند و امکان بررسی بهتر نمونه زیر میکروسکوپ را فراهم می‌سازد.

بر اساس نوع نمونه و هدف آزمایش، ممکن است از روش‌های رنگ‌آمیزی اختصاصی یا آزمایش‌های تکمیلی نیز استفاده شود.

۱۱. لامل‌گذاری و آماده‌سازی اسلاید نهایی

پس از رنگ‌آمیزی، مقطع بافت با استفاده از محیط مانت مناسب آماده شده و لامل (Coverslip) روی آن قرار می‌گیرد.

لامل از مقطع محافظت می‌کند و شرایط مناسب‌تری برای مشاهده و نگهداری اسلاید فراهم می‌سازد.

در پایان، اسلاید باید با مشخصات مناسب شناسایی و برای بررسی میکروسکوپی یا آرشیو آماده شود.

تجهیزات و ملزومات مورد نیاز برای آماده‌سازی بافت

یک آزمایشگاه پاتولوژی برای انجام فرآیند آماده‌سازی نمونه به تجهیزات و مواد مصرفی مختلفی نیاز دارد.

چگونه کیفیت آماده‌سازی نمونه بافت را افزایش دهیم؟

کیفیت اسلاید نهایی نتیجه عملکرد صحیح تمام مراحل است. برای دستیابی به نتایج قابل قبول، رعایت چند اصل اهمیت ویژه‌ای دارد.

استفاده از مواد مصرفی استاندارد

کیفیت پارافین، تیغ میکروتوم، کاست، لام و لامل می‌تواند روی نتیجه نهایی تأثیر بگذارد.

اجرای صحیح برنامه Tissue Processing

زمان و شرایط آب‌گیری، شفاف‌سازی و نفوذ پارافین باید متناسب با نوع و اندازه نمونه انتخاب شود.

کنترل کیفیت فیکساسیون

نمونه باید در شرایط مناسب و با فیکساتیو مناسب نگهداری شود تا ساختار بافت تا حد امکان حفظ شود.

نگهداری صحیح تجهیزات

تجهیزاتی مانند میکروتوم، تیشو پروسسور و دستگاه‌های رنگ‌آمیزی باید طبق دستورالعمل سازنده تمیز، نگهداری و سرویس شوند.

رعایت اصول ایمنی آزمایشگاه

برخی مواد مورد استفاده در آزمایشگاه پاتولوژی، مانند فرمالین و حلال‌های آلی، نیازمند رعایت الزامات ایمنی و تهویه مناسب هستند. استفاده از تجهیزات حفاظت فردی و اجرای دستورالعمل‌های ایمنی آزمایشگاه ضروری است.

چک‌لیست مواد مصرفی آزمایشگاه پاتولوژی

اگر قصد تجهیز یا تأمین مواد مصرفی بخش پاتولوژی را دارید، موارد زیر از جمله اقلامی هستند که ممکن است در فرآیند آماده‌سازی نمونه مورد نیاز باشند:

• کاست بافت
• پارافین پاتولوژی
• تیغ میکروتوم
• لام میکروسکوپی
• لام چسب‌دار
• لامل میکروسکوپی
• ظروف نمونه پاتولوژی
• مواد فیکساسیون
• مواد مورد استفاده در پردازش و رنگ‌آمیزی بافت
• محیط مانتینگ

انتخاب هر محصول باید متناسب با نوع نمونه، تجهیزات موجود، حجم کاری و پروتکل مورد استفاده در آزمایشگاه انجام شود.

جمع‌بندی؛ فرآیند آماده‌سازی نمونه بافت در پاتولوژی

مراحل آماده‌سازی نمونه بافت در آزمایشگاه پاتولوژی از دریافت و فیکساسیون نمونه آغاز می‌شود و پس از Grossing، آب‌گیری، شفاف‌سازی و نفوذ پارافین، با قالب‌گیری، برش‌گیری، انتقال روی لام، رنگ‌آمیزی و لامل‌گذاری ادامه پیدا می‌کند.

در هر مرحله، استفاده از تجهیزات و مواد مصرفی مناسب می‌تواند به اجرای استاندارد فرآیند کمک کند. محصولاتی مانند کاست بافت، پارافین پاتولوژی، تیغ میکروتوم، لام، لامل و ظروف نمونه از جمله ملزومات پرکاربرد این بخش هستند.

برای مشاهده و خرید محصولات مورد نیاز، می‌توانید دسته‌بندی تجهیزات و مواد مصرفی آزمایشگاه پاتولوژی را بررسی کنید و محصولات متناسب با نیاز آزمایشگاه خود را انتخاب نمایید.

سوالات متداول درباره آماده‌سازی نمونه بافت

مراحل آماده‌سازی نمونه بافت در آزمایشگاه پاتولوژی چیست؟

مراحل اصلی شامل دریافت نمونه، فیکساسیون، Grossing، قرار دادن در کاست، آب‌گیری، شفاف‌سازی، نفوذ پارافین، قالب‌گیری، برش‌گیری، انتقال مقطع روی لام، رنگ‌آمیزی و آماده‌سازی اسلاید نهایی است.

Tissue Processing چیست؟

Tissue Processing به مجموعه مراحلی گفته می‌شود که نمونه بافت پس از فیکساسیون طی می‌کند تا آب و مواد واسط از آن خارج شده و برای نفوذ پارافین و قالب‌گیری آماده شود.

برای برش نمونه بافت از چه دستگاهی استفاده می‌شود؟

برای برش‌گیری از بلوک‌های پارافینی معمولاً از میکروتوم استفاده می‌شود. نوع تیغه و تنظیمات دستگاه بر کیفیت مقاطع تأثیر دارند.

کاست بافت چه کاربردی دارد؟

کاست بافت برای نگهداری و شناسایی نمونه در مراحل مختلف پردازش بافت استفاده می‌شود و امکان جابه‌جایی نمونه در فرآیند Tissue Processing را فراهم می‌کند.

پارافین در پاتولوژی چه کاربردی دارد؟

پارافین برای نفوذ به بافت و ایجاد یک بلوک نسبتاً سفت استفاده می‌شود تا نمونه برای برش‌گیری با میکروتوم آماده شود.

رایج‌ترین رنگ‌آمیزی در پاتولوژی چیست؟

رنگ‌آمیزی H&E یا هماتوکسیلین و ائوزین یکی از روش‌های رایج برای بررسی مورفولوژی بافت و سلول‌هاست.