اسپور

توضیحات

رنگ آمیزی اسپور
اسپور شکل مقاوم سلول رویشی در برخی باکتری هاست. از باکتری های بی هوازی جنس های کلستریدیوم و دسولفوتو ماکولوم، و از باکتری های هوازی جنس با سیلوسها از جمله میکروارگانیسم هایی هستند که دارای قدرت تشکیل اسپور هستند.

وقتی شرایط محیط برای رویش این سلول ها نامناسب شود (بعنوان مثال تمام شدن منبع کربن)، این سلول ها تشکیل اسپور می دهند.

از آنجایی که این اسپورها درون سلول تشکیل می شوند به آن ها اندوسپور گفته می شود. اسپور توسط لایه های نفوذ ناپذیری به نام پوشش اسپور احاطه شده است. اگر شرایط نامساعد محیطی همچنان ادامه یابد و بدتر شود اندوسپورها از درون سلول رویشی آزاد شده و به صورت خارج سلولی (غیر وابسته به سلول) درمی آیند که دراین صورت اسپور نامیده می شوند.

وجود ترکیبات شیمیایی در لایه های اسپور آن ها را نسبت به اثرات زیان بار حرارت بالا، انجماد، امواج رادیویی، و مواد شیمیایی همچون رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی مقاوم می کند . با فراهم شدن شرایط محیطی مناسب، اسپورها به صورت سلول رویشی فعال در می آیند.

رنگ آمیزی اسپور به دو روش انجام می شود:

رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین (یا رنگ آمیزی شافر فولتون schaeffer-falton)
رنگ آمیزی اسپور به روش روش هانسن
وش مالاشیت گرین رنگ آمیزی اسپور باکتری
رنگ آمیزی مالاشیت گرین در سه مرحله انجام می شود.

1) رنگ اولیه : مالاشیت گرین
به دلیل وجود پوشش های غیر قابل نفوذ در اطراف اسپور، رنگ پذیری آن به راحتی صورت نمی گیرد. برای نفوذ بهتر رنگ وجود حرارت الزامی است. به همین دلیل بعد از ریختن مالاشیت گرین روی گسترش، عمل حرارت دادن انجام می گیرد. در پایان این مرحله، سلول رویشی و اسپور، هر دو سبز رنگ خواهند شد.

2) معرف رنگ بر
آب قادر به رنگ بری اسید نیست و نمی تواند رنگ را از اسپور خارج کند. از طرف دیگر مالاشیت گرین تمایل زیادی به تر کیبات سلول های رویشی نشان نمی دهد. بنابراین آب می تواند به راحتی رنگ را از سلول رویشی خارج کند. در این صورت سلول های رویشی بی رنگ شده و آماده پذیرش رنگ بعدی می شوند.

3) رنگ متضاد : (سافرانین)
از این معرف برای رنگ پذیری سلول های رویشی استفاده می شود، بنابراین جذب سلول ها شده و آن ها را قرمز رنگ می کند حال آنکه اسپور به رنگ سبز باقی مانده است.

مواد مورد نیاز برای رنگ آمیزی اسپور با روش مالاشیت گرین

کشت ها
از کشت نوترینت آگار 48 تا 72 ساعته باکتری با سیلوس سرئوس (B. cereus) و S. aureus و کشت تیوکلیکولات آکارباکتری کلستریدیوم استفاده می شود.

معرف ها
مالاشیت گرین (malachit green) و سافرانین (safranin)

وسایل
شعله، هات پلیت (hot plate)، سینی رنگ آمیزی، لوپ تلقیح، لام های شیشه ای، کاغذ خشک کن، کاغذ عدسی و میکروسکوپ

پروتکل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین
تهیه گسترش ازباکتری اسپوردار و بدون اسپور به صورت مخلوط
خشک کردن در مجاورت هوا
فیکساسیون توسط حرارت
افزودن مالاشیت گرین روی گسترش و حرارت دادن به مدت 5 دقیقه
سرد کردن گسترش و شستشوی آن با جریان ملایم آب
افزودن سافرانین روی گسترش به مدت 30 ثانیه
شستشوی گسترش با جریان ملایم آب
خشک کردن با کاغذ خشک کن و مشاهده با میکروسکوپ به کمک عدسی x 100

مشاهدات، نتایج و گزارش کار رنگ آمیزی اسپور با روش مالاشیت گرین
بعد از مشاهده تمام لام ها به کمک عدسی x 100 ، نتایج خود را ثبت کنید.

تصویری از یک میدان دید میکروسکوپی هر نمونه بکشید و جایگاه اندوسپور درون سلول رویشی را مشخص کنید که آیا مرکزی، نزدیک به انتها یا انتهایی (بترتیب central ، subterminal و terminal) هستند، همچنین رنگ اسپور و سلول رویشی را مشخص کنید.

رنگ آمیزی اسپور به روش هانسن
روش هانسن طی مراحل زیر انجام می گیرد:

بعد از تهیه گسترش، خشک شدن در هوا و فیکساسیون توسط حرارت، مراحل زیر صورت می گیرد.

افزودن رنگ کربول فوشین روی گسترش و حرارت دادن آن به مدت 15-10 دقیقه.
سرد کردن گسترش وشستشوی آن با جریان ملایم آب.
رنگبری با محلول اسید استیک 5% به نحوی که لام صورتی رنگ شود.
شستشوی گسترش با جریان ملایم آب.
افزودن متیلن بلو بر روی گسترش به مدت 3 دقیقه.
شستشوی گسترش با جریان ملایم آب.
خشک کردن گسترش، مشاهده با میکروسکوپ ( x 100)

در این حالت اسپور به رنگ قرمز و سلول رویشی، آبی رنگ دیده می شود