تری‌ کروم ماسون

توضیحات

تعریف رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون یک روش رنگ‌ آمیزی مربوط به آسیب‌ شناسی بافتی است که برای رنگ‌ آمیزی انتخابی کلاژن (Collagen)، فیبرهای (Fiber) کلاژن، فیبرین (Fibrin)، ماهیچه‌ ها و گلبول‌ های قرمز استفاده می‌ شود.

این روش از سه رنگ برای رنگ‌ آمیزی استفاده می‌ کند، از این رو از اصطلاح Trichrome برای نام‌گذاری آن استفاده شده است. این سه رنگ عبارتند از:

هماتوکسیلین وایگرت (Weigert’s Hematoxylin)
محلول بیبریچ اسکارلت اسید فوشین (Biebrich scarlet-acid fuschin solution)
آنیلین بلو (Aniline blue)

اهداف رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
برای رنگ‌ آمیزی فیبرهای کلاژ (Collage)
برای رنگ‌ آمیزی کلاژن
برای رنگ‌ آمیزی کراتین (Keratin)
برای رنگ‌ آمیزی فیبرین
برای رنگ‌ آمیزی فیبرهای عضلانی

اصول رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
با استفاده از این سه رنگ، تکنیک رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون برای شناسایی فیبرهای کلاژن در بافت‌ هایی مانند پوست، قلب و ماهیچه‌ ها استفاده می‌ شود. نمونه‌ ها شامل برش‌ های فیکس‌ شده با فرمالین، برش‌ های پوشیده شده با پارافین یا بخش‌ های منجمد هستند. هماتوکسیلین وایگرت، یک رنگ هماتوکسیلین آهن است که برای رنگ‌ آمیزی هسته‌ ها استفاده می‌ شود.
این رنگ در برابر رنگ‌ زدایی توسط محلول‌ های رنگ‌ آمیزی اسیدی مقاوم است. محلول بیبریچ اسکارلت اسید فوشین تمام بافت‌ های اسیدی مانند سیتوپلاسم، ماهیچه و کلاژن را رنگ می‌کند.

اسید فسفومولیبدیک (Phosphomolybdic) یا اسید فسفوتنگستیک (Phosphotungstic) به عنوان یک عامل رنگ‌ زدا استفاده می‌ شود که باعث می‌شود بیبریچ اسکارلت اسید فوشین از فیبرهای کلاژن پخش شود. این امر باعث می‌ شود سلول‌ های ماهیچه‌ ای قرمز رنگ شوند. آنیلین بلو کلاژن را رنگ می‌ کند که در آن اسید استیک 1 درصد به آن اضافه می‌ شود تا تفاوت در بخش‌ های بافت نشان داده شود. فیبرهای کلاژن به رنگ آبی و هسته‌ ها به رنگ سیاه، با پس‌زمینه قرمز رنگ‌ آمیزی می‌ شوند.

رنگ آمیزی تری‌ کروم ماسون
اغلب تکنیک‌ های رنگ آمیزی افتراقی که برای بافت‌ های پیوندی به کار برده می‌ شود، در دسته رنگ‌ آمیزی به روش تری کروم قرار می‌ گیرند.

رنگ آمیزی به روش تری کروم، یک تکنیک رنگ آمیزی در آزمایشگاه است که در آن از دو یا چند رنگ اسیدی به همراه پلی اسید استفاده می‌شود تا دو ماده به روش افتراقی و در دو رنگ متضاد رنگ آمیزی شوند. رایج‌ ترین کاربرد این روش، رنگ آمیزی فیبر عضلات به رنگ قرمز و رشته کلاژن به رنگ سبز یا آبی است. از آنجایی که ممکن است افتراق فیبرهای عضلات صاف از رشته کلاژن دشوار باشد، رنگ‌ آمیزی تری کروم اهمیت زیادی دارد. رنگ آمیزی تری کروم به شناسایی افزایش بافت کلاژن (به عنوان مثال تغییرات فیبروتیک مانند سیروز کبدی) و همچنین تشخیص تومورهای ناشی از سلول‌ های عضلانی و فیبروبلاست کمک می‌ کند.

تری کروم ماسون و تری کروم گوموری دو مورد از تکنیک‌ های رایج رنگ‌ آمیزی‌ های تری کروم در آزمایشگاه هستند.

۱. رنگ‌ آمیزی به روش تری کروم ماسون 
۱-۱. آماده‌ سازی محلول‌ ها
همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد در تکنیک رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون از دو یا چند رنگ اسیدی به همراه پلی اسید استفاده می‌ شود. در ادامه به بررسی مواد و محلول‌ هایی که در این تکنیک استفاده می‌ شود و نحوه آماده‌ سازی هریک خواهیم پرداخت. توجه داشته باشید که توصیه می‌ شود در مرحله‌ ی پردازش بافت از محلول تثبیت فرمالین ۱۰% یا محلول بوئن استفاده کرده و برش ۵ میکرومتری از بافت پارافین‌ گیری شده را روی لام رنگ‌ آمیزی کنید.

۱-۱-۱. محلول بوئن: استفاده از محلول بوئن کیفیت رنگ‌ آمیزی به روش تری‌ کروم ماسون را بهبود می‌ بخشد.

آماده‌ سازی محلول بوئن:

اسید پیکریک (اشباع شده) ——————- ۷۵ میلی‌ لیتر
فرمالین غلیظ ۴۰%-۳۷% ——————- ۲۵ میلی‌ لیتر
استیک اسید گلاسیال ——————- ۵ میلی‌ لیتر
این سه ماده را به خوبی با یکدیگر مخلوط کنید.

۲-۱-۱. محلول هماتوکسیلین آهن Weigert

آماده‌ سازی استوک محلول A:
هماتوکسیلین——————- ۱ گرم
الکل ۹۵٪ ——————- ۱۰۰ میلی‌لیتر

آماده‌سازی استوک محلول B:

کلرید فریک محلول در آب ۲۹% ——————- ۴ میلی‌ لیتر
آب مقطر ——————————- ۹۵ میلی‌ لیتر
اسید هیدروکلریک غلیظ ———————— ۱ میلی لیتر
قسمت‌ های مساوی محلول استوک A و B را مخلوط کنید. این محلول برای ۳ ماه پایدار است و استفاده از آن بعد از گذشت ۴ ماه از زمان آماده‌ سازی توصیه نمی‌ شود.

۳-۱-۱. محلول بیبریچ اسکارلت – اسید فوشین

بیبریچ اسکارلت محلول در آب ۱% ——————- ۹۰ میلی‌ لیتر
اسید فوشین محلول در آب ۱% ———————- ۱۰ میلی‌ لیتر
استیک اسید گلاسیال —————————— ۱ میلی‌ لیتر

۴-۱-۱. محلول اسید فسفو مولیبدیک – فسفو تنگستیک 

اسید فسفو مولیبدیک ۵٪ ————- ۲۵ میلی‌ لیتر
اسید فسفو تنگستیک ۵٪ ———— ۲۵ میلی‌ لیتر

۵-۱-۱. محلول آنیلین بلو 

آنیلین بلو ——————————- ۲/۵ گرم
استیک اسید گلاسیال ——————— ۲ میلی‌ لیتر
آب مقطر ——————————- ۱۰۰ میلی‌ لیتر

۱-۱-۶. محلول اسید استیک 1٪:

استیک اسید گلاسیال —————— ۱ میلی لیتر
آب مقطر —————————- ۹۹ میلی‌ لیتر

۲-۱. مراحل رنگ‌ آمیزی به روش تری‌ کروم ماسون
۱. ابتدا مراحل پارافین‌ زدایی و هیدراسیون را با استفاده از الکل ۱۰۰% ، ۹۰% و ۷۰% انجام دهید.

۲. بافت را به کمک آب مقطر بشویید.

۳. چنانچه بافت در فرمالین تثبیت شده است، جهت بهبود کیفیت رنگ‌ آمیزی، بافت را به مدت ۱ ساعت در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد و به کمک محلول بوئن مجددا فیکس کنید. البته این مرحله ضروری نیست و تنها جهت بهبود کیفیت رنگ‌ آمیزی پیشنهاد می‌ شود.

۴. آب لوله‌ کشی را به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه باز کنید تا آب زرد رنگ باقی مانده در لوله رد شود.

۵. لام را به مدت ۱۰ دقیقه در محلول کاربردی هماتوکسیلین آهن Weigert قرار دهید.

۶. سپس لام را به مدت ۱۰ دقیقه با آب بشویید.

۷. لام را با آب مقطر آبکشی کنید.

۸. لام را به مدت ۱۰ الی ۱۵ دقیقه در محلول بیبریچ اسکارلت – اسید فوشین قرار دهید. محلول را می‌ توان برای استفاده در آینده نگهداری کرد.

۹. لام را با آب مقطر بشویید.

۱۰. جهت افتراق (Differentiate) از محلول اسید فسفو مولیبدیک – فسفو تنگستیک استفاده کنید. لام را به مدت ۱۰ الی ۱۵ دقیقه (تا زمانی که کلاژن قرمز نشود) در این محلول قرار دهید.

۱۱. لام را مستقیماً (بدون آبکشی) به محلول آنیلین بلو منتقل کرده و اجازه دهید به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه در محلول باقی بماند. سپس برای مدتی کوتاه لام را با استفاده از آب مقطر آبکشی کنید.

۱۲. مجددا جهت افتراق، لام را به مدت ۲ الی ۵ دقیقه در محلول اسید استیک ۱٪ قرار دهید و سپس با آب مقطر بشویید.

۱۳. لام را با استفاده از اتیل الکل ۹۵% و اتیل الکل ۱۰۰% دهیدراسیون کنید. این مرحله باعث از بین رفتن بیبریچ اسکارلت – اسید فوشین می‌ شود.

۱۴. در انتها لام را با استفاده از زایلین شفاف (clear) کنید

۳-۱ نتایج

کلاژن ——————————— آبی
هسته‌ ها —————————— سیاه
عضله‌، سیتوپلاسم‌، کراتین —————- قرمز

کاربردهای رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
برای مطالعه دیستروفی (Dystrophy) عضلانی و سایر پاتولوژی‌ های عضلانی.
برای مطالعه عفونت‌ های قلبی و سایر پاتولوژی‌ های قلبی.
برای مطالعه پاتولوژی‌ های کبدی مانند سیروز (Cirrhosis).
برای مطالعه پاتولوژی‌ های کلیه مانند فیبروز گلومرولی (Glomerular fibrosis).
برای شناسایی و تجزیه و تحلیل تومورها در بیوپسی‌های (biopsy) کبد و کلیه.

مزایای رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
می‌ توان از آن برای اندازه‌ گیری و افتراق رسوب کلاژن در مقایسه با روش رنگ‌ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین Y (Hematoxylin-Eosin Y) استفاده کرد.
در مقایسه با سایر رنگ‌ ها، تصاویر واضحی از فیبر کلاژن ایجاد می‌ کند.
از بسیاری از تکنیک‌ های رنگ‌ آمیزی دقیق‌ تر است.

محدودیت‌ های رنگ‌ آمیزی تری کروم ماسون
محلول‌ های ذخیره باید ظرف 24 ساعت پس از آماده‌ سازی استفاده شوند.
رنگ‌ آمیزی باید با احتیاط و با پوشیدن لباس محافظ انجام شود تا در معرض خورندگی شناساگرهای مورد استفاده قرار نگیریم.