توضیحات
رنگ آمیزی تری کروم ویتلی (Wheatley Trichrome Staining)
تعریف، اصول، روش و تفسیر نتایج رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
رنگ آمیزی تری کروم ویتلی چیست؟
تکنیک رنگ آمیزی تری کروم ویتلی یک رنگ پایدار ویژه است که در انگل شناسی برای تشخیص و شناسایی تک یاخته های روده در نمونه های مدفوع استفاده می شود.
رنگ آمیزی تری کروم بر روی نمونه مدفوع تثبیت شده با PVA یا نگهداری شده با روش Schaudinn انجام می شود.
مورفولوژی تک یاخته های شناسایی شده به صورت کیست ها (Cyst) و تروفوزوئیت ها (Trophozoite) شناخته شده است.
Gomori این رنگ را در سال 1951 ایجاد کرد و بعدا در سال 1952 توسط Wheatley اصلاح شد و مراحل تثبیت کننده و هیدراتاسیون (Hydration) را به روش اولیه اضافه کرد و یک تکنیک رنگ آمیزی سریع و در عین حال ساده برای آمیب ها و تاژک داران روده ایجاد کرد.
اصول رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
در روش رنگ آمیزی تری کروم ویتلی از نمونه های مدفوع یا فیلم مدفوع استفاده می شود که برای تسهیل تشخیص و شناسایی کیست ها و تروفوزوئیت ها به طور دائمی رنگ آمیزی می شوند. این روش بسیار حساس است، از این رو می تواند تک یاخته های کوچکی را که در طول معاینه از قلم افتاده‌اند، شناسایی کند. رنگ تریکروم ویتلی یک رنگ اصلاح شده از روش اصلی بافت Gomori است.
این تکنیک یک پروسه ساده دارد که به سرعت انجام می شود. این روش اسمیرهای به صورت یکنواخت رنگ آمیزی شده ای از تک یاخته های روده‌ای، مخمرها، مصنوعات و سلول های انسانی تولید می کند. نمونه مدفوع مورد استفاده باید تازه باشد، یا در پلی‌وینیل الکل (Polyvinyl alcohol (PVA)) تثبیت یا در سدیم استات- استیک اسید- فرمالین (sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF)) نگهداری شده باشد.
آماده سازی شناسگرها
تری کروم (فرمولاسیون ویتلی)
کروموتروپ 2R، به مقدار 6 گرم
لایت گرین SF، به مقدار 0.3 گرم
اسید فسفوتنگستیک 0.7 گرم
اسید استیک گلاسیال 1.0 میلی لیتر
آب مقطر 100 میلی لیتر
1 میلی لیتر اسید استیک به اجزای خشک اضافه کرده و اجازه دهید به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق بماند. سپس 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید تا رنگ محلول به بنفش تغییر کند. محلول باید از نور محافظت شده و در یک بطری شیشه‌ای یا پلاستیکی در دمای اتاق نگهداری شود. ماندگاری محلول 24 ماه است.
اتانول 70% به علاوه ید: برای تهیه محلول ذخیره، کریستال های ید را به الکل 70% اضافه کنید تا محلولی تیره بدست آید (1 تا 2 گرم در 100 میلی لیتر). برای استفاده، محلول ذخیره را با الکل 70 درصد رقیق کنید تا رنگ قهوه ای مایل به قرمز تیره یا رنگ چای پر رنگ به دست آید.
اتانول 70%
اتانول اسیدی 90%: با مخلوط کردن 99.5 میلی لیتر اتانول با 0.5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال تهیه می شود.
اتانول 95%
اتانول 100%
زایلن (Xylene) یا جایگزین زایلن
محیط مانتینگ (Mounting medium) (Permount)
روغن ایمرسیون (Immersion oil)
روش رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
توجه: هنگام اجرای رنگ آمیزی تری کروم ویتلی دستکش بپوشید.
آماده‌سازی مدفوع
نمونه مدفوع تازه را آماده کنید. نمونه های کوچکی از مدفوع را با استفاده از اپلیکاتور (Applicator stick) روی لام های میکروسکوپی استریل تمیز قرار دهید تا اسمیرهای بسیار نازکی از نمونه ایجاد کنید.
نمونه را خشک نکنید و بلافاصله اسلایدها را در فیکساتور Schaudinn قرار داده و اجازه دهید برای 30 دقیقه تثبیت شود. اگر نمونه مدفوع آبکی است، 3 یا 4 قطره PVA را روی اسمیر لام (لام با یک نمونه مدفوع) اضافه کنید و خوب مخلوط کنید و بگذارید چند ساعت در دمای 35 تا 37 درجه سانتیگراد یا یک شب در دمای اتاق بماند تا خشک شود.
رنگ آمیزی اسمیرها
توجه: برای آماده سازی اسمیر PVA، آن را به مدت 10 دقیقه در محلول ید – الکل (اتانول 70٪ به اضافه ید) قرار دهید. برای نمونه های دیگر با فیکساتورهای مختلف بدون کلرید جیوه (Mercuric chloride)، مرحله ید را حذف کنید.
لام را از فیکساتور Schaudinn برداشته و آن را به مدت 5 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را برای نمونه های مدفوع تازه به مدت یک دقیقه یا برای نمونه های خشک شده با هوای نگهداری شده با PVA به مدت 5 تا 10 دقیقه در اتانول 70 درصد به اضافه ید قرار دهید.
لام را به مدت 5 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را به مدت 3 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را به مدت 10 دقیقه در رنگ تریکروم قرار دهید.
لام را در اتانول 90 درصد قرار دهید و اسید استیک را به مدت 1 تا 3 ثانیه اضافه کنید و بلافاصله قفسه را آبکشی کنید و به مرحله بعد بروید. اجازه ندهید اسلاید در این محلول باقی بماند.
لام حاوی اسمیر را در اتانول 100% فرو ببرید. این مرحله، مرحله آبکشی است.
لام را در دو تعویض از اتانول 100% به مدت 3 دقیقه برای هر تعویض قرار دهید.
آن را به مدت 5 تا 10 دقیقه در زایلبن قرار دهید.
اسمیر را با یک لامل با استفاده از یک محیط مانتینگ مانند پرمونت (permount) به عمل آورید.
اجازه دهید اسمیر یک شب یا حداقل 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد بماند تا خشک شود.
اسمیر را به صورت میکروسکوپی با بزرگ نمایی 100 برابر بررسی کنید. نمونه را با میکروسکوپ روغن ایمرسیون با بزرگ نمایی 200 تا 300 برابری بررسی کنید.
نتایج و تفسیر رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
تروفوزوئیت ها و کیست های تک یاخته ای را بررسی کنید.
سیتوپلاسم تروفوزوئیت های تک یاخته ای به رنگ آبی – سبز یا بنفش روشن رنگ می شود.
کیست ها بیشتر ارغوانی به نظر می رسند.
وجود مخمر و سلول های انسانی مانند گلبول های قرمز خون، سلول های پلی‌مورفونوکلئر (PolyMorphonuclear cells (PMNs)) و ماکروفاژها (Macrophage) را می توان شناسایی کرد. آن ها به رنگ قرمز در می‌آیند.
هسته ها و اجسام انکلوژنی (Inclusion body) نیز به رنگ بنفش کم رنگ در می آیند.
پس زمینه سبز رنگ می شود که کنتراست زیادی با تک یاخته ها از خود نشان می دهد.
مولکول های گلیکوژن (Glycogen) توسط حلال های رنگ، حل می شوند و مانند ارگانیسم شفاف به نظر می رسند.
محدودیت های رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
تخم ها و لاروهای هلمینت (Helminth) را نمی‌توان به طور دائم توسط رنگ تری کروم ویتلی رنگ آمیزی کرد.
برای شناسایی و بررسی تک یاخته ها، مشاهده رنگ نیاز به بزرگ نمایی بالا زیر لنز روغن ایمرسیون دارد و ممکن است برخی از مورفولوژی های تک یاخته ها از قلم بیافتد.
برخی از تک یاخته ها را نمی توان با استفاده از رنگ آمیزی تری کروم ویتلی شناسایی کرد مانند: کریپتوسپوریدیوم پارووم (Cryptosporidium parvum) و سیکلوسپورا کایتاننسیس (Cyclospora cayetanensis).
اسپورهای میکروسپوریدیا (Microsporidia) را نمی توان با استفاده از اسمیر رنگ آمیزی شده با تری کروم ویتلی مشاهده کرد.
کاربردهای رنگ آمیزی تری کروم ویتلی
برای تشخیص عفونت تک یاخته های روده ای.
برای شناسایی مورفولوژی های انگلی.
برای شناسایی سلول های مخمری مختلف.
برای شناسایی سلول های انسانی.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.