توضیحات
رنگ آمیزی سودان بلک (سیتولوژی)
همانطور که می دانید رنگ آمیزی یکی از تکنیک های مهم و پایه ای برای تشخیص میکروارگانیسم ها و تشخیص بیماری ها و اختلالات گوناگون است. میکروارگانیسم های مختلف در ساختار خود اجزایی دارند که با رنگ آمیزی آن ها می توان نوع میکروارگانیسم را شناسایی کرد. به طور مثال در سیتوپلاسم برخی از باکتری ها قطرات چربی وجود دارد که میل ترکیب با رنگ های محلول در چربی را دارند. رنگ های خانواده سودان (Sudan) در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی جهت شناسایی اینگونه باکتری ها و بررسی و مشاهده لیپیدها مورد استفاده قرار می گیرند.
در این مطلب قصد داریم مروری بر تکنیک رنگ آمیزی سودان بلک B (Sudan Black B) که یکی از اجزای خانوده سودان است داشته و مراحل انجام این تکنیک رنگ آمیزی را بیان کنیم.
مروری بر سودان بلک B و کاربرد آن
همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، رنگ های خانواده سودان برای رنگ آمیزی چربی ها در ساختار میکروارگانیسم ها و همچنین قطرات چربی در بافت کاربرد گسترده ای دارند. سودان II، سودان III، سودان IV، روغن قرمز O و سودان بلک B از اعضای این خانواده هستند. رنگ های خانواده سودان از نظر ساختاری، جزء رنگ های دیازو هستند، یعنی رنگ هایی که به طور تجاری در رنگ آمیزی منسوجات، پوشاک و پلاستیک استفاده می شوند. با این وجود، در آزمایشگاه ها برای رنگ آمیزی نمونه های بیولوژیکی و چربی ها و لیپیدها نیز کاربرد گسترده ای دارند. در این بین، سودان بلک B کاربرد گسترده تری داشته و برای بررسی لیپیدها در بافت توصیه می‌شود.
سودان بلک B برای اولین بار در سال 1934 میلادی توسط شخصی به نام L. Lison معرفی شد.
این عضو از خانواده سودان غیر فلورسنت و نسبتاً حرارتی (relatively thermostable) است که برای رنگ آمیزی تری گلیسیریدها و لیپیدهای خنثی در نمونه بافت فریز شده و برخی لیپوپروتئین ها استفاده می شود. سودان بلک B با ترکیبات اسیدی در لیپیدها ترکیب شده و فسفو لیپیدها، لیپوپروتئین ها و تری گلیسیریدهای موجود در نمونه را رنگ آمیزی می کند.
سایر رنگ های سودان اغلب مخصوص لیپیدها هستند. اما سودان بلک B مانند سایر رنگ های سودان نیست و می توان از آن برای رنگ آمیزی کروموزوم ها، دستگاه گلژی و گرانول های لکوسیت نیز استفاده کرد.
از ویژگی های سودان بلک B می توان به موارد زیر اشاره نمود:
مشخصات ظاهری: پودر قهوه‌ای رنگ متمایل به سیاه
حداکثر جذب در 596 الی 605 نانومتر
نقطه ذوب 120 الی 124 درجه سانتیگراد
برخی از ارگانیسم هایی که با استفاده از رنگ آمیزی سودان سیاه B قابل شناسایی هستند، عبارتند از:
باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)
باسیلوس مایکوئیدس (Bacillus mycoides)
ازتوباکتر بیجراينکي (Azotobacter beijerinckii)
ریزوبیوم leguminosarum
مایکوباکتریوم آویوم (Mycobacterium avium)
مایکوباکتریوم لپرا (Mycobacterium leprae)
قارچ (fungi)
مواد و محلول های مورد استفاده در تکنیک رنگ‌آمیزی سودان بلک B
در ادامه مواد و محلول های مورد استفاده در رنگ آمیزی سودان بلک B را ذکر خواهیم کرد.
۱. فیکساتیو:
بافر فرمالین خنثی 10%
۲. بافت:
برش پارافین 5 میکرومتری یا برش فریز 8 میکرومتری
۳. محلول سودان بلک B:
سودان بلک B (C.I. 26150) …………………..ء 1.0 گرم
ایزوپروپیل الکل ………………………………………… 70.0 میلی لیتر
پودر سودان بلک B را با ایزوپروپیل الکل ترکیب کرده و به مدت 30 دقیقه روی هات پلیت قرار دهید. 0.3 گرم دکسترین را در 30 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و به ترکیب سودان بلک اضافه کنید. افزودن دکسترین به سودان سیاه B به تثبیت محلول و در نتیجه افزایش ماندگاری آن (شش ماه یا بیشتر) کمک می کند. محلول را به مدت 5 دقیقه مخلوط کرده و سپس از کاغذ فیلتر عبور دهید. محلول را قبل از استفاده مجددا فیلتر کنید.
۴. محلول نوکلئار فست رد:
0.1 گرم نوکلئار فست رد را به کمک گرما در ۱۰۰ میلی لیتر محلول سولفات آلومینیوم ٪۵ حل کنید. اجازه دهید محلول خنک شود و سپس آن را فیلتر کنید. در نهایت چند دانه تیمول به عنوان ماده نگهدارنده اضافه کنید.
۵. ژل گلیسیرین:
ژلاتین ………………….. 10.0 گرم
آب مقطر …………….. 60.0 میلی لیتر
مواد را با استفاده از هات پلیت حرارت دهید تا ژلاتین حل شود.
سپس مواد زیر را به ترکیب بالا اضافه کنید.
گلیسرین ……………….. 70.0 میلی لیتر
فنل ذوب شده ……………….. 1.0 میلی لیتر
مراحل رنگ آمیزی با استفاده از سودان بلک B
برای رنگ آمیزی بافت مورد نظر خود با استفاده از تکنیک سودان بلک B مراحل زیر را طی کنید. اگر از بافت های فریز شده استفاده می کنید، رنگ آمیزی را از مرحله 3 آغاز نمایید.
۱. مراحل پارافین زدایی را انجام دهید و بافت را با استفاده از الکل 70٪ هیدراته کنید.
۲. لام را درون جای لام شیار دار قرار دهید و اجازه دهید خشک شود.
۳. لام را به مدت 1 الی 3 ساعت درون محلول سودان بلک B قرار دهید.
۴. اگر از بافت های فریز شده استفاده می کنید، لام را به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق درون سودان بلک B قرار دهید.
۵. لام را دو مرتبه با ایزوپروپیل الکل 70٪ بشویید.
۶. لام را 6 مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۷. لام را به مدت 3 دقیقه درون محلول نوکلئار فست رد قرار دهید.
۸. پس از گذشت 3 دقیقه، لام را 2 مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۹. لام را با استفاده از ژل گلیسیرین تثبیت کنید.
نتایج رنگ آمیزی به روش سودان بلک B
فسفو لیپیدها ………………… آبی مایل به سیاه یا سیاه
چربی ها ………………………… آبی مایل به سیاه یا سیاه
گلبول های قرمز …………… سرمه‌ای
هسته ………………………… صورتی
جمع بندی
همانطور که گفته شد رنگ های خانواده سودان دسته ای از رنگ های دی‌آزو هستند که نه تنها در صنایع منسوجات بلکه در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی نیز کاربرد گستره ای دارند. سودان بلک B یکی از اعضای این رنگ ها است که برای بررسی چربی انباشته شده در بافت و یا شناسایی و تشخیص ارگانیسم هایی که در ساختار خود چربی دارند، استفاده می شود. لیپیدها و فسفو لیپیدها در رنگ آمیزی سودان بلک به رنگ آبی متمایل به سیاه مشاهده می شوند. اما توجه داشته باشید که نتایج رنگ آمیزی حاصل از رنگ های سودان همیشه یکسان نیست. به عنوان مثال در رنگ آمیزی روغن قرمز O، که یکی از اعضای رنگ های سودان است، لیپیدها به رنگ قرمز مشاهده می شوند.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.