پاس

توضیحات

رنگ‌ آمیزی پاس (رنگ‌ آمیزی پریودیک اسید شیف) PAS
روش رنگ‌ آمیزی پاس (رنگ‌ آمیزی پریودیک اسید شیف) PAS که اغلب با نام تکنیک رنگ‌ آمیزی پاس PAS شناخته می‌ شود، یکی از روش‌ های رنگ‌ آمیزی رایج در آزمایشگاه‌ های هیستوپاتولوژی است که برای شناسایی پلی‌ ساکاریدها (مانند گلیکوژن) و مواد مخاطی (مانند گلیکو پروتئین‌ ها، گلیکو لیپیدها و موسین‌ ها) موجود در بافت استفاده می‌ شود. در این مطلب قصد داریم شما را با تکنیک رنگ‌ آمیزی پاس، محلول‌ های مورد استفاده در این تکنیک و روش تهیه آن‌ ها و همچنین نتایج حاصل از این روش رنگ‌آمیزی آشنا کنیم.

تکنیک رنگ‌ آمیزی پاس چگونه به متخصصین پاتولوژی کمک می‌ کند؟
تکنیک رنگ‌ آمیزی پاس در شناسایی کربوهیدرات‌ها کاربرد گسترده‌ ای دارد. واکنش بین پریودیک اسید شیفت و کربوهیدارت‌ های موجود در سلول‌ های یک بافت، فرایندی اکسیداتیو (oxidative process) است. همانطور که در بخش مقدمه نیز گفته شد تکنیک رنگ‌ آمیزی پاس برای شناسایی پلی‌ ساکاریدها مانند گلیکوژن و مواد مخاطی موجود در بافت استفاده می‌ شود. سلول‌ های بافت دارای مقادیر مختلفی از گلیکوژن هستند و رنگ پاس باعث اکسیده شدن این گلیکوژن می‌ شود. در اثر این واکنش، یک ترکیب اکسیداز به نام آلدهید (Aldehydes) ایجاد می‌ شود. آلدهیدها به دلیل معرف بی‌رنگ شیف (colorless Schiffs fuchsin) به رنگ صورتی، سرخابی یا قرمز در می‌آیند.

کاربردهای رنگ آمیزی پاس
رنگ‌ آمیزی پاس کاربردهای زیادی در حوزه‌ های مختلف آزمایشگاهی دارد. به همین دلیل پیش از اینکه به سراغ روش رنگ‌ آمیزی و محلول‌ های مورد استفاده در این تکنیک برویم، اجازه دهید مروری کوتاه بر برخی از کاربردهای این تکنیک رنگ‌ آمیزی رایج داشته باشیم.

سیتولوژی (Cytology): رنگ‌ آمیزی پاس در شناسایی غیر افتراقی تومورها و در تشخیص سرطان غدد آدنوکارسینوم  مورد استفاده قرار می‌گیرد.

آسیب‌ شناسی (Pathology): از دیگر کاربردهای رنگ‌ آمیزی پاس می‌توان به آسیب‌ شناسی کبد و کلیه اشاره کرد.

مطالعات قارچ‌ شناسی (Fungal studies): از روش رنگ‌ آمیزی پاس می‌ توان برای نشان دادن هیف‌ های قارچی (fungal hyphae) و مخمرهای قارچ (yeast-forms) در نمونه‌ های بافتی استفاده کرد. این بررسی‌ ها در شناسایی عفونت‌ های کاندیدا آلبیکانس، آسپرژیلوس فومیگاتوس و کریپتوکوکوس نئوفورمانس موثر است.

آسیب‌ شناسی دستگاه گوارش: برای تشخیص وجود مخاط در دستگاه گوارش نیز از روش رنگ‌ آمیزی پاس استفاده می‌ شود.

مطالعات ریوی: از رنگ پاس جهت بررسی پروتئينوز آلوئولي یا آمورفی نیز استفاده می‌ شود.

پوست: برای مطالعه بدن‌ های گلوبوئید

نمونه برداری از عضلات: برای نشان دادن اجزای گلیکوژن.

روش رنگ‌ آمیزی پاس برای تشخیص سرطان پروستات، آسیب‌ شناسی پانکراس، مشکلات روده کوچک و بیضه و همچنین برای تشخیص گرانول‌ ها در سیتوشیمی آنزیمی نیز کاربرد دارد.

روش رنگ‌ آمیزی پاس
در ادامه قصد داریم تا در ابتدا شما را مواد و محلول‌ های مورد استفاده در روش رنگ‌‌ آمیزی پاس و نحوه‌ آماده‌ سازی هر یک آشنا کرده و سپس به بررسی روش رنگ‌ آمیزی پاس و نتایج آن بپردازیم. دقت داشته باشید که در این روش از برش‌ های ۴ میکرومتری بافت پارافین‌ گیری شده، استفاده شده است.

۱. مواد و محلول‌ های مورد نیاز رنگ‌ آمیزی پاس
۱-۱. فیکساتیو:

بافر فرمالین خنثی ۱۰%، فیکساتیو Zenker’s هر ماده تثبیت کننده‌ ی مناسب دیگر.

توجه داشته باشید که اگر رنگ‌ آمیزی پاس بر روی بافت انجام می‌ شود، بهتر است از بافر فرمالین خنثی ۱۰% یا محلول بوئن (Bouin solution) به‌عنوان فیکساتیو استفاده شود. اما در رابطه با اسمیر خون، متانول به عنوان فیکساتیو توصیه می‌ شود.

همچنین استفاده از گلوتارآلدئید (Glutaraldehyde) توصیه نمی‌ شود زیرا گروه‌ های آلدهیدی آزاد ممکن است با معرف شیف واکنش نشان داده و منجر به نتایج مثبت کاذب شوند.

۱-۲. محلول پریودیک اسید % ۰/۵:

پریودیک اسید ——————————————– ۰/۵ گرم

آب مقطر ———————————————— ۱۰۰/۰میلی‌ لیتر

۱-۳. محلول Modified Lillies Schiff:

۰/۳ گرم پاراروزانیلین (pararosanilin) را در ۲۰ میلی لیتر اتیل الکل ۲۰٪ حل کنید.

۸۰ میلی لیتر آب مقطر، ۲/۰ گرم سدیم متا بی‌ سولفیت (sodium metabisulfite) ، ۰/۱۵ گرم سدیم هیدرو سولفیت (sodium hydrosulfite) را به محلول بالا اضافه کرده و کاملاً مخلوط کنید.

سپس ۱/۰ میلی لیتر اسید کلریدریک (hydrochloric acid) و ۰/۳ گرم زغال فعال (ctivated charcoal) را به محلول اضافه کنید.

محلول را 3 دقیقه هم بزنید و از طریق کاغذ فیلتر رد کنید. رنگ محلول باید مثل آب شفاف باشد.

معرف شیف را در یخچال و در دمای 3 الی 6 درجه سانتیگراد نگهداری کنید. در صورت نگهداری در یخچال، محلول حداقل یک سال ماندگار است.

۱-۴. سدیم بورات % ۰/۳:
سدیم بورات (Na2 B4 O7 10H2O) ——————————— ۰/۳ گرم

آب مقطر ————————————– ۱۰۰/۰ میلی لیتر

۲. مراحل رنگ‌ آمیزی پاس
۱. مراحل پارافین‌ زدایی و هیدراسیون را انجام دهید.

۲. نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه در محلول پریودیک اسید قرار دهید تا اکسیده شود. اگر نمونه کلیه، پوست و یا بیوپسی کبد است، این زمان را به ۱۵ دقیقه افزایش دهید.

۳. لام را ۴ مرتبه با استفاده از آب مقطر آبکشی کنید.

۴. نمونه را به مدت ۱۵ دقیقه در محلول Modified Lillies Schiff قرار دهید. برای نمونه‌ های کلیه و پوست این زمان را به ۳۰ دقیقه افزایش دهید.

۵. سپس مجددا لام را 4 مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۶. لام را به مدت ۱۵ ثانیه در سدیم بورات ۰/۳٪ قرار دهید و سپس ۴ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۷. لام را به مدت ۴۵ ثانیه در هماتوکسیلین اسیدی شده لیلی-مایر قرار دهید و سپس آن را ۳ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۸. نمونه را در سدیم بورات % ۰/۳ قرار دهید و پس از گذشت ۱۵ ثانیه آن‌ را ۴ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۹. دهیدراسیون را به کمک درجه‌ بندی‌ ها و غلظت‌ های مختلف الکل انجام داده و سپس لام را با استفاده از زایلین شفاف (clear) کنید.

۳. بررسی نتایج رنگ‌ آمیزی پاس
گلیکوژن، موسین، رتیکولوم (reticulum)، کلوئید (colloid droplets)، رسوبات هیالین در گلومرول‌ها (hyaline deposits in glomeruli)، غشاهای پایه، کلوئید ساقه هیپوفیز و تیروئید —————————– قرمز یا بنفش

قارچ‌ ها —————————————— قرمز

هسته —————————————— آبی

۴. نکات مهم در مورد رنگ‌ آمیزی پاس
۱. این موضوع که آیا معرف شیف قابل استفاده است یا خیر را می‌ توان با ریختن چند قطره از معرف در ۱۰ میلی‌ لیتر فرمالدئید با درجه واکنش (۴۰-۳۷٪) در یک بشر کوچک آزمایش کرد. اگر محلول به سرعت به بنفش مایل به قرمز تبدیل شود، قابل استفاده است. اما اگر واکنش به تأخیر بیفتد و رنگ آن به رنگ آبی-بنفش متمایل باشد، محلول قابل استفاده نبوده و باید دور ریخته شود.

۲. فرمول معرف Lillies Schiff اصلاح شده است. این محلول اصلاح شده برای تهیه، به پاراروزانیلین کمتری احتیاج دارد، خیلی سریع‎تر آماده می‌ شود، نتایج رنگ آمیزی مطلوبی دارد و به نظر می‌ رسد ثبات بیشتری نسبت به فرمول اصلی داشته باشد.

جمع‌بندی
امروزه الگوهای هیستوشیمیایی به عنوان ابزارهای تشخیصی ارزشمند و مقرون به صرفه در حوزه‌ ی آسیب‌ شناسی به کار می‌ روند و تغییراتی جزئی در این الگوها می‌ تواند به تشخیص زود هنگام بسیاری از بیماری ‌ها و همچنین شناسایی پاتوژن‌ های مختلف کمک کند. روش رنگ آمیزی پاس یکی از پرکاربردترین تکنیک‌ ها برای نشان دادن گلیکوپروتئین‌ ها ، کربوهیدرات ها و مخاط و بررسی الگوهای هیستوشیمیایی است. به همین دلیل در این مطلب سعی کردیم این روش رنگ‌ آمیزی، کاربردها و نتایج حاصل از آن را توضیح دهیم.

توجه داشته باشید که تکنیک‌ های رنگ‌آمیزی ممکن است در آزمایشگاه‌ های مختلف متفاوت باشند و روش توضیح داده شده در این مقاله تنها یکی از انواع روش‌ های رنگ‌ آمیزی پاس به شمار می‌ رود.