توضیحات
رنگ آمیزی کنگو رد (آمیلوید)
آمیلوئید (Amyloid) به رسوبات غیر طبیعی خارج سلولی و پروتئینی موجود در اندام ها و بافت ها اشاره دارد. آمیلوئید در طیف وسیعی از بیماری ها دیده می شود. این بیماری ها عبارتند از آلزایمر، آنسفالوپاتی های اسفنجی شکل و دیابت نوع II که همگی اختلالاتی پیشرونده با عوارض و مرگ و میر بالا هستند. به همین دلیل جای تعجب نیست که تحقیقات در مورد خواص فیزیکو شیمیایی آمیلوئیدها از اهمیت بالایی برخوردار باشد. در آزمایشگاه های پاتولوژی، جهت شناسایی و تشخیص آمیلوئیدها از تکنیک رنگ آمیزی کنگو رد (CONGO RED) استفاده می شود.
ما اینجا قصد داریم به مرور این تکنیک پرداخته و نتایج حاصل از رنگ آمیزی کنگو رد را بیان کنیم.
مروری اجمالی بر رنگ کنگو رد
کنگو رد، برای اولین بار در سال 1883 میلادی توسط یک شیمیدان به نام پل بوتینگر (Paul Bottinger)، کشف شد. کنگو رد (سرخ کنگو) به عنوان جوهر بیولوژیکی و شناساگر اسید باز نیز کاربرد دارد که در محلول های بازی، سرخ و در محلول های اسیدی، آبی رنگ است.
کنگو رد در اثر پیوند بنزیدین دی آزو بیس (bis-diazotized benzidine) با دو مولکول اسید ناپتیونیک (napthionic acid) سنتز می شود.
طی این واکنش رنگ آبی حاصل می شود. پس از آن طی افزودن کلرید سدیم، رنگ به دست آمده به نمک دی سدیم قرمز رنگ تبدیل می گردد.
مواد و محلول های مورد استفاده
محلول تثبیت کننده: بافر فرمالین خنثی 10%
نمونه مورد استفاده: بخش های پارافین گیری شده در ابعاد 6 میکرون.
۱. هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده
آماده سازی استوک محلول A :
هماتوکسیلین —————— ۱ گرم
الکل ۹۵٪ ——————۱۰۰ میلی‌لیتر
آماده سازی استوک محلول B :
کلرید فریک محلول در آب ( ۲۹%) ——————- ۴ میلی لیتر
آب مقطر ——————————- ۹۵ میلی لیتر
اسید هیدروکلریک غلیظ ———————— ۱ میلی لیتر
قسمت های مساوی محلول استوک A و B را مخلوط کنید. این محلول برای ۳ ماه پایدار است و استفاده از آن بعد از گذشت ۴ ماه از زمان آماده سازی توصیه نمی شود.
۲. محلول سدیم کلرید – الکل
سدیم کلرید ———————————————- ۲/۵ گرم
آب مقطر ———————————————— 50 میلی لیتر
الکل مطلق ———————————————– 50 میلی لیتر
کلرید سدیم را در آب مقطر حل کنید و سپس الکل مطلق را به آن اضافه کنید. این محلول برای چندین ماه پایدار است.
۳. پتاسیم هیدروکسید 1%
پتاسیم هیدروکسید —————————————– ۱/۰ گرم
آب مقطر ———————————————— ۱۰۰/۰ میلی لیتر
۴. محلول کنگو رد
محلول سدیم کلرید الکل ————————————– 50 میلی لیتر
قرمز کنگو (I. 22120) ————————————– ۰/۱ گرم
پتاسیم هیدروکسید 1% —————————————- ۰/۵ گرم
کنگو رد را در محلول کلرید سدیم الکل حل کنید، سپس پتاسیم هیدروکسید را به آن اضافه کنید.
محلول نهایی را به کمک کاغذ صافی فیلتر کنید. این محلول حدود یک ماه پایدار است.
مراحل رنگ آمیزی کنگو رد
نمونه بافت را پارافین زدایی کرده و با استفاده از آب مقطر مراحل هیدراسیون را انجام دهید.
لام را به مدت 10 ثانیه در هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده قرار دهید.
سپس لام را چند ثانیه زیر شیر آب نگه دارید. لام را دو مرتبه درون جار رنگ آمیزی حاوی آب مقطر فرو ببرید.
لام را به مدت 5 ثانیه در محلول الکل اسید قرار دهید و به مدت 1 دقیقه زیر شیر آب بشویید.
سپس آن را دو مرتبه درون جار رنگ آمیزی حاوی آب مقطر فرو ببرید.
در مرحله بعدی، لام را به مدت 5 ثانیه در الکل 95 درصد قرار دهید.
سپس آن را به مدت 20 دقیقه در محلول کنگو رد قرار دهید.
در نهایت مراحل دهیدراسیون را به کمک الکل 95 درصد و الکل مطلق انجام دهید.
مراحل شفاف سازی به کمک زایلین را انجام داده، لامل را روی لام قرار داده و نمونه را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.
نتایج حاصل از رنگ آمیزی کنگو رد
آمیلوئید ——————————————— صورتی یا قرمز
هسته ———————————————– مشکی
گلبول های قرمز ————————————— نارنجی کم‌رنگ
گرانول ائوزینوفیل ————————————– نارنجی مایل به قرمز
توضیحات
برخی موارد در روش رنگ آمیزی کنگو رد از alum hematoxylin به عنوان ضد رنگ (counterstain) استفاده می شود. این امر منجر به ایجاد یک پس زمینه ضعیف، نامطلوب و صورتی می شود. با استفاده از هماتوکسیلین آهن وایگرت اصلاح شده، به جای alum hematoxylin، هیچ رنگ پس زمینه ای ایجاد نمی شود.
رنگ کنگو رد در الکل 50 درصد بیشتر از الکل 80 درصد حل می شود. محلول غلیظ تر، رنگ آمیزی بهتری برای آمیلوئید ایجاد می کند و پایداری بسیار بیشتری دارد.
جمع‌بندی
آمیلوئیدها رسوبات غیر طبیعی هستند که در برخی بیماری ها مانند آلزایمر در بافت های بدن تجمع می یابند. به همین دلیل شناسایی این رسوبات از اهمیت زیادی در تشخیص بیماری فرد برخوردار است. تکنیک رنگ آمیزی کنگو رد روشی برای شناسایی آمیلوئیدها است که در این مطلب به آن پرداخته شد.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.